【目的】克隆获得棉铃虫(Helicoverpa armigera)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的c DNA序列,分析Ha PEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内Ha PEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到Ha PEBP的c DNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将Ha PEBP的ORF序列连接至p ET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中Ha PEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的变化规律。【结果】获得的Ha PEBP c DNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 k D和5.93。氨基酸序列分析表明Ha PEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-p ET32a-Ha PEBP重组菌用1 mmol·L-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 k D的融合蛋白His-Ha PEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L-1的咪唑洗涤两次后得到约40 k D的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μL-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。Ha PEBP在棉铃虫幼虫的1—6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内Ha PEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g-1)在6 h就能降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g-1)在12 h才会降低Ha PEBP的表达量,其m RNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了Ha PEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-Ha PEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示Ha PEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内Ha PEBP的表达量显著降低。

【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT-PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21(DE3)系统中进行原核表达,使用GSTrapFF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2(GenBank登录号:EU647241)的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457bp,编码149个氨基酸残...

目的了解棉铃虫体内Gqα的组织特异性表达情况。方法利用RACE技术获得了Gqα全长基因,利用半定量RT-PCR研究了该基因的时空表达情况。结果从棉铃虫Helicoverpaarmigera触角中克隆了一条全长1101bp的GqαcDNA序列,命名为GqαHarm;阅读框全长1062bp,编码353个氨基酸残基。GqαHarm与已报道的昆虫Gq蛋白α亚基同源性在90%以上,与近缘种甘蓝夜蛾MamestrabrassicaeGqα的同源性高达96.88%,与家蚕BombyxmoriGqα的同源性高达97.73%。半定量RT-PCR研究表明,GqαHarm在棉铃虫雌雄成虫触角中表达,在头、胸、腹、足...

【目的】克隆及序列分析棉铃虫(Helicoverpa armigera)α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因(HeTubA),采用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因(GenBank登录号为JQ069957)。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分...

【目的】克隆棉铃虫中肠羧酸酯酶基因,了解该酶的分子特性,为研究棉铃虫抗药性机理奠定基础。【方法】制备抗血清,对棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hübner))中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,得到编码棉铃虫羧酸酯酶基因的cDNA克隆,利用生物信息学软件和网站进行序列分析,构建原核表达载体进行表达,并以α-醋酸萘酯溶液为底物进行活性测定。【结果】测序分析表明,羧酸酯酶基因hc3(GenBank登录号:GU119888)全长2 896 bp,编码795个氨基酸。羧酸酯酶HC3的等电点pI为3.94,活性中心包括3个氨基酸残基(催化三联体):Ser204,Glu331,His444...

昆虫围食膜是保护其中肠的一道物理屏障,破坏围食膜就可能使其中肠处于不正常的生理状态而最终导致死亡。本研究提取棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)围食膜蛋白,成功制备棉铃虫围食膜蛋白多克隆抗体,并对棉铃虫中肠cDNA表达文库进行免疫筛选,共得到385个阳性克隆。对其中26个克隆进行鉴定并测序分析,结果表明19个克隆为肠粘蛋白。过碘酸-希夫试剂(PAS)显色法检测棉铃虫围食膜蛋白组成,发现围食膜蛋白大部分为糖蛋白。通过对棉铃虫中肠围食膜蛋白的分离鉴定,为进一步分析棉铃虫围食膜蛋白的生理功能,寻找生物防治新靶标,开发新型高效生物杀虫剂提供理论依据。

【目的】明确不同食源异色瓢虫(Harmonia axyridis)胁迫对棉铃虫(Helicoverpa armigera)生长发育和变态发育的影响,探讨棉铃虫是否能感知并分级捕食风险、能否在生长发育和变态发育上体现出权衡效应;明确长时和短时胁迫对棉铃虫压力蛋白基因表达的影响,探讨异色瓢虫胁迫能否引起棉铃虫分子水平上的生理反应。【方法】通过设置7种不同食源的异色瓢虫胁迫处理(饥饿处理、虾卵处理、棉铃虫幼虫处理、棉铃虫卵处理、蚜虫处理、蚜虫对照处理、对照处理),观察记录棉铃虫在胁迫下的生长发育(幼虫历期、蛹历

[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机制奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目的蛋白进行纯化，使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值(CAI)从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22～122),IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22～122),3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22～122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22～122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。

[目的]本文旨在通过建立棉铃虫效应蛋白HARP1体外表达纯化体系，对HARP1蛋白进行体外表达和纯化，为解析HARP1蛋白与植物茉莉酸信号途径中JAZ蛋白的互作分子机理奠定基础。[方法]对harp1基因序列进行密码子优化，使用蛋白预测软件预测HARP1中的信号肽和成熟肽。基于以上信息构建目的蛋白的表达质粒并进行诱导表达，使用亲和层析、酶切、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析等多种手段对目的蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE和Western blot对蛋白进行分析和检测。[结果]通过优化将harp1基因密码子适应度值（CAI）从0.39提升到0.95。蛋白预测软件预测N末端21个氨基酸为信号肽，信号肽与成熟肽切割位点在第21位丙氨酸和第22位亮氨酸之间，成熟肽为第22位亮氨酸至第122位精氨酸。构建表达质粒pETDuet1-His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，IPTG能够诱导目的蛋白表达，使用Ni-NTA柱纯化出融合蛋白His6-MBP-3C-HARP1(22-122)，3C蛋白酶能够切除His6-MBP标签，使用阴离子交换柱成功分离His6-MBP标签和HARP1(22-122)蛋白，使用Superdex 200 increase Gel Filtration Column进一步纯化获得单体HARP1(22-122)蛋白。[结论]成功建立HARP1蛋白体外表达与纯化体系。

检测紫外光(ultra violet,UV)照射后棉铃虫HMG-CoA还原酶基因、卵黄原蛋白基因的表达量及棉铃虫产卵量的变化。提取经UV照射后棉铃虫雌虫的总RNA并反转录为cDNA。利用荧光定量PCR(qPCR)技术检测HMG-CoA还原酶基因及卵黄原蛋白基因的表达量。UV照射后,统计棉铃虫雌虫的产卵量。结果表明:UV照射0.5~5.0 h,棉铃虫HMG-CoA还原酶基因的表达量显著增加;UV照射1.0~5.0 h,24 h后取样发现棉铃虫卵黄原蛋白基因的表达量显著增加;UV照射1.0~4.0 h,棉铃虫雌虫的产卵量显著增加。研究结果证实UV照射能影响棉铃虫hmgr、vg的表达量和雌虫的产卵量...

【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得...

【目的】研究棉铃虫(Helicoverpa armigera)中肠蛋白ABCC1(HaABCC1)与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系(96S)和Cry1Ac抗性品系(BtR)棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系(BtR)与敏感品系(96S)棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。

棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)ORF44是一个功能未知的基因,研究对HearNPV ORF44基因的序列及原核表达进行了初步研究。结果表明,HearNPV ORF44基因全长1 137 nt,编码378aa,预测编码蛋白分子量为42.7 ku。序列分析显示,ORF44具有双相启动子特征序列,同时兼有杆状病毒早期和晚期基因转录启动子特征序列。ORF44的推导氨基酸序列中含有1个强跨膜螺旋区域,32个磷酸化位点和4个糖基化位点。除HzNPVORF45外,未发现与ORF44氨基酸同源性高于30%的基因。构建了pET-44表达载体,并在大肠杆菌BL21中得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量为4...

为进一步拓展广谱高效生物增效剂——重组昆虫病毒增效蛋白P96的应用潜能,研究了P96对棉铃虫幼虫生长发育和成虫产卵量的影响效果.结果表明,与饲喂清水相比,棉铃虫幼虫取食P96后体重增长极显著减缓,发育延迟,累计化蛹达50%的时间推迟2.1～3.4d,蛹重减轻4.90%～5.21%,成虫产卵量减少52.62%～65.68%,P96对棉铃虫生长发育和繁殖有明显的弱化作用.

为深入了解心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的结构与功能,采用RACE技术克隆得到暗纹东方鲀H-FABP的全长cDNA序列,共772 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。生物信息学分析表明,暗纹东方鲀H-FABP基因具有一个脂质转运蛋白家族保守结构域和多个蛋白激酶磷酸化位点。NJ法系统进化分析显示,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系最近,其次是鲈形目。经荧光定量PCR检测,H-FABP基因在暗纹东方鲀所有被检测的组织中都有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次为肌肉和心脏,预示H-FABP主要参与脂肪酸氧化分解...