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[期刊] 华北农学报
[作者]
李波 倪志勇 范玲
为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
陈珍珍 曾显成 池雪林 白丁平 刘云辉 胡可慧 罗树红 黄小红
本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.
关键词：
羊口疮病毒 ORF080蛋白 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孟星宇 李婷 李沐 刘宁 田玉华 胡薇
【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李晨宇 足木热木·吐尔逊 李晓荣 杨洋 李波 于月华
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用，而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值，因此，从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列，并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，通过Gataway BP和LR反应，将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件，最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示，GhMYB42(XP＿016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸，预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现，MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域，是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示，陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP＿012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显，因此，选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明，重组蛋白的大小正确，最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白，后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。
[期刊] 华北农学报
[作者]
姜楠 郑倩倩 李倩文 涂健 宋祥军 邵颖 刘红梅 祁克宗
兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室前期预测了新的ETT2伴侣分子YgeG,为了获得大量有活性的YgeG蛋白,对其功能进行鉴定,并筛选出与其相关的具有活性的ETT2分泌效应蛋白,将对目的蛋白原核表达条件进行优化。以禽致病性大肠杆菌菌株81(AE81)为模板对基因ygeG进行扩增,将扩增产物克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6p-1-ygeG,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,并对重组蛋白的诱导条件进行优化。SDS-PAGE及Western Blot鉴定结果显示,本试验中表达的最佳条件为:IPTG终浓度为0.25 mmol/L,16℃诱导16 h。重组蛋白大小约为44 ku,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中高效表达,主要以可溶性蛋白的形式存在,并且具有良好的免疫原性和反应原性。成功表达了AE81-YgeG蛋白,为该蛋白的结构和功能及ETT2的深入研究奠定基础,为禽大肠杆菌病的防治提供理论依据。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张伟 李翠萍 杨志军 何广杰
采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杨艳艳 王丽 杨继飞 郅玉宝 滕蔓 邓瑞广 肖治军 张改平
利用RT-PCR技术,将狂犬病病毒株ERA株糖蛋白胞外区基因分两段进行扩增,经克隆与序列分析,两片段大小分别为523,381 bp,各编码174,127个氨基酸,分子量分别为19.7,14.5 kDa。在原核表达载体pET-43a中分别克隆了这两段糖蛋白基因,将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为94,89kDa处分别出现新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。两重组蛋白主要以可溶形式表达,利用Ni2+亲和层析柱纯化了蛋白,纯度大于95%。Western-Blot分析结果显示,两种重组融合蛋白均可与兔抗RBV多抗血清反应,具有良好的反应原性。
关键词：
狂犬病病毒 糖蛋白 胞外区 纯化
[期刊] 华北农学报
[作者]
谢玮怡 毕燕会 周志刚
为研究海带核基因组编码的nuc Cbb X蛋白的结构和功能,根据海带配子体核基因cbb X(Gen Bank登录号:NP_053838)设计含有酶切位点的引物,通过RT-PCR方法获得末端连接NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的完整ORF。序列保守性分析表明,预测的海带成熟nuc Cbb X蛋白序列含具有AAA+结构域、Walker-A和Walker-B ATP结合位点及ATP水解酶和Ru Bis Co活化酶活性相关位点。序列相似度分析表明,海带nuc Cbb X与其质体基因组编码的pt Cbb X和类球红细菌的Rs Cbb X蛋白氨基酸序列相似度均较低,分别为37.4%和36.8%,相比pt Cbb...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
周佳平 林新春 徐英武
SEPALLATA3(SEP3)属于花器官建成ABCE模型中的E类基因,为了揭示SEP3蛋白是如何形成多聚体的,以及多聚体与其生物学功能之间的联系,开展了拟南芥Arabidopsis thaliana AtSEP3蛋白质体外可溶性表达实验,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌Escherichia coli细胞中进行重组蛋白的诱导表达。从蛋白不同的结构域、诱导时间和诱导温度等方面对蛋白的可溶性表达进行了分析。最后以pET-15b为表达载体,大肠埃希菌表达菌株E.coli‘Rosetta’为宿主菌株,22℃诱导表达15 h,获得不同片段的AtSEP3可溶性蛋白。通过镍柱及分子层析色谱柱分离纯化,表...
[期刊] 海洋渔业
[作者]
朱欣云 丁少青 张哲 任建峰 濮家飞 贾亮 李伟明 张庆华
海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
薄慧杰 卢长明 吴刚 武玉花 肖玲 白延红 陈耀锋
通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
翟留涛 秦魏 刘娜女 奚绪光
【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRE
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
万超 邓婷榕 胡莉 伍炳华 袁媛
茉莉花JsMYB108转录因子可以调控茉莉萜类合成酶基因JsTPS2的表达，是香气合成相关的转录因子.本试验将茉莉JsMYB108转录因子的编码序列利用酶切连接方法构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，转化大肠杆菌BL21(DE3)株系，设定了4个IPTG诱导浓度(0.1、0.2、0.5、1.0 mmol·L~(-1))和3个诱导温度(20、28、37℃)用于筛选合适的蛋白诱导条件，在此基础上对诱导出来的蛋白进行分离纯化和检测.结果表明：4个IPTG浓度均可成功诱导出分子质量约为59 ku的融合蛋白，不同IPTG浓度间诱导表达的蛋白量无显著差异；20、28、37℃均可诱导出融合蛋白，但相比28、37℃的诱导温度，20℃过夜诱导表达下的可溶性蛋白含量最高，更有利于重组蛋白的纯化.后续用0.1 mmol·L~(-1) IPTG、20℃作为大量诱导JsMYB108融合蛋白的条件，利用GST亲和树脂分离纯化了融合蛋白，并通过Western blotting对纯化的蛋白进行了验证.研究结果可为后期筛选JsMYB108互作蛋白及其蛋白功能的研究提供参考.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘静 韩丽 李任峰 徐萍 鲁毅 杨猛 王三虎
【目的】对来航鸡ＦＯＸＬ２基因进行真核表达及纯化，为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的来航鸡ＦＯＸＬ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ＿７０８８６８．１）设计引物，以来航鸡全血Ｄｎａ为模板，ＰＣＲ扩增ＦＯＸＬ２基因，经ｅＣＯＲⅠ和ＸＢａⅠ双酶切后定向克隆于ＰＰＩＣＺαａ中，获得ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体。将ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２转化毕赤酵母菌ＧＳ１１５，用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行ＳＤＳ－ＰａＧｅ和ＷｅＳｔｅＲｎ ＢＬＯｔｔＩｎＧ检测。【结果】克隆了９１８ＢＰ的ＦＯＸＬ２基因；成功构建了ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体；实现了ＦＯＸＬ２．．．
关键词：
来航鸡 FOXL2基因 真核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王帅锋 刘娜女 段晓磊 罗亦欣 范三红 奚绪光
【目的】通过原核表达系统获得热脱硫弧菌（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｙｅｌｌｏｗｓＴｏｎｉｉ ｈ．）Ｐｉｆ１解旋酶（ＴｙＰｉｆ１），研究ＴｙＰｉｆ１解旋酶的嗜热特性和解旋机理。【方法】将ＴｙＰｉｆ１解旋酶编码区和ｓｕｍｏ促溶标签编码区融合连入ＰｅＴ１５ｂ获得重组表达载体ＰｅＴ１５ｂ－ｓｕｍｏ－ＴｙＰｉｆ１，将该重组载体导入大肠杆菌ｂｌ２１（ｄｅ３）菌株诱导表达，经ｎｉ－ｎＴＡ柱亲和纯化获得融合蛋白，ｓｕｍｏ蛋白酶切除标签，再经ｎｉ－ｎＴＡ柱去除标签蛋白及ｓｕｍｏ蛋白酶，经ｈｅＰＡｒｉｎ柱进一步纯化最终获得ＴｙＰｉｆ１全长蛋白。通过荧光各向异性、圆二色谱（Ｃｄ）和荧光共振能量转移（ｆ．．．
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