[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。

[目的]本文旨在克隆陆地棉U-box E3泛素连接酶基因GhPUB19D并分析其在抵御生物和非生物胁迫中的功能及其作用机制。[方法]利用PCR从棉花cDNA文库中扩增盐胁迫和大丽轮枝菌处理均上调表达的GhPUB19D全长cDNA;qRT-PCR分析GhPUB19D的组织表达特征及其对不同非生物胁迫处理的响应;构建pBIN-GhPUB19D-GFP载体并导入烟草叶片中,分析GhPUB19D的亚细胞定位;利用病毒介导的基因沉默(VIGS)和转基因过表达GhPUB19D基因分析该基因对植物的耐盐性和抗病性的影响。[结果]GhPUB19D基因ORF全长2 043 bp,编码680个氨基酸,其编码的蛋白质含有1个U-Box和3个ARM结构域,定位于高尔基体。GhPUB19D基因启动子区存在多种逆境胁迫响应顺式作用元件。GhPUB19D在棉花根和叶片中优势表达。聚乙二醇(PEG)、NaCl、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)处理后,均可诱导GhPUB19D在1 h达到表达峰值。VIGS沉默GhPUB19D棉花在接种大丽轮枝菌Vd991之后,叶片黄化和枯萎较正常植物更为严重,植株发病率和病情指数均极显著增加。转GhPUB19D基因可以提高拟南芥在ABA处理下的种子萌发率,但不能减轻ABA对幼苗生长的抑制作用;转GhPUB19D基因可以提高拟南芥幼苗的耐盐性,ABA的SnRK2.3/2.6信号通路下游的AtABF3和AtABF4对盐胁迫的响应增强,而AtRD26、AtMYB44、AtRAB18、SLAH3等对盐胁迫的响应减弱。转GhPUB19D基因可以显著减轻大丽轮枝菌病症,显著降低拟南芥植株中大丽轮枝菌含量,提高AtPR1、AtPR2、AtPR3、AtPR4、AtPR5、AtNPR1等系统获得抗性相关基因的表达及其对大丽轮枝菌的响应。[结论]过量表达GhPUB19D可显著提高植物的耐盐性和黄萎病抗性。

为探究甘蔗PROTEOLYSIS 1(PRT1)基因与黑穗病菌的互作关系，以甘蔗割手密种和栽培品种为研究对象，通过RT-PCR技术对ScPRT1(GenBank登录号：MT747433)基因进行克隆，生物信息学分析、定量PCR、亚细胞定位和基因共表达网络分析。生物信息学分析表明，该基因的cDNA全长为1 621 bp,包含一个长度为1 260 bp,编码419个氨基酸的完整开放读码框；其编码蛋白的分子量为46.56 ku,为酸性、不稳定的亲水蛋白，无信号肽，具有核定位信号；该蛋白包含2个RING结构域和1个ZZ结构域；ScPRT1蛋白的高级结构元件多为无规则卷曲。定量PCR结果显示，ScPRT1在皮、叶片、芽中的表达量相差不大，在蔗髓中表达量最高。同时该基因的表达受脱落酸胁迫后显著上调；受黑穗病菌胁迫后，在甘蔗抗黑穗病品种中上调表达，在感黑穗病品种中下调表达，都达到了显著水平。亚细胞定位结果揭示，ScPRT1定位于细胞核。寄主甘蔗和病原黑穗病菌的基因共表达网络中，与甘蔗ScPRT1共表达的黑穗病菌基因中，有3个为N端具有芳香族氨基酸残基的黑穗病菌效应蛋白，这暗示它们之间存在直接的相互作用。以上结果表明，ScPRT1在甘蔗激素信号传导以及响应黑穗病菌侵染过程中发挥重要作用。

COP1 E3连接酶是一个光形态建成的抑制子和光调控植物发育的分子开关。对山核桃Carya cathayensis花芽454测序获得Cc COP1 E3连接酶的片段,通过c DNA末端快速扩增技术(RACE),分别获得该基因的全长,大小为2 331 bp,它由2个特殊的结构域组成即环形锌指结合域和WD-40重复序列,其编码的蛋白质有较强的亲水性,在氨基端主要是亲水性氨基酸,而羧基端主要是疏水性氨基酸。Cc COP1 E3连接酶与毛果杨Populus trichocarpa等的COP1 E3连接酶同源基因相似度较高,总体高达77.80%。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)结...

为探究大黄鱼ＭＡＲＣＨ５Ａ的免疫作用，实验采用反转录ＰＣＲ确认了该基因的Ｃ ＤＮＡ序列。该序列全长１０４５ ｂＰ，包含１个长度为８６７ ｂＰ的开放阅读框，编码２８８个氨基酸；序列分析显示该蛋白含１个ＲＩＮＧｖ和４个跨膜结构域。进化树分析表明大黄鱼有１１个ＭＡＲＣＨ家族蛋白（与哺乳动物相同），但鱼类存在多个亚型，ＭＡＲＣＨ５Ａ为鱼类特有蛋白，其蛋白理化性质和三维结构均与ＭＡＲＣＨ５ｂ存在一定的差异。荧光定量ＰＣＲ分析显示，ＭＡＲＣＨ５Ａ在健康大黄鱼的多个组织中均有表达，在血液和心脏中表达量最高，其次为鳃和脑，而在肾脏和皮肤中表达量最少。刺激隐核虫感染大黄鱼后，ＭＡＲＣＨ５Ａ在皮肤中早期表达量显著．．．

【目的】为了验证‘无子瓯柑’Citrus suavissima ‘Seedless’ E3泛素连接酶基因CsRNF217对雄蕊育性的影响，采用异源转化获得过表达CsRNF217的转基因烟草Nicotiana tabacum，分析其对烟草育性的影响。【方法】采用亚历山大染色法、花粉离体培养法、杂交授粉后的结实率分析野生型烟草及转基因烟草自交1代(T_1)阳性株系的花粉活力及胚囊育性，利用半定量RT-PCR分析基因CsRNF217在转基因烟草T_1阳性株系花药中的表达强弱。【结果】‘无子瓯柑’CsRNF217在转基因烟草自交T_1株系中高效表达，转基因株系的花粉染色活力和离体萌发率、自交结实率、以及与野生型的正反交结实率均显著低于野生型(P<0.05)。【结论】过表达CsRNF217的烟草植株花粉育性显著下降，同时伴随胚囊育性下降的现象，推测CsRNF217基因对‘无子瓯柑’雌雄育性存在负向调控的作用。图5表3参22

【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子,明确其表达特征,分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆(78L16)的测序结果,首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列,并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS连接的重组载体pGbNocotin::GUS,并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株,分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框(ORF)序列,并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树...

为探究GhFUL1基因在棉花分枝发育进程中的功能，从棉花中克隆MADS-box家族GhFUL1基因及其启动子，对该基因进行功能研究，并对其启动子进行活性分析。结果表明，棉花中GhFUL1基因开放阅读框726 bp,编码241个氨基酸。进化树分析表明，GhFUL1与其他物种中可可的TcAGL8-1亲缘关系最近。烟草亚细胞定位分析结果表明，GhFUL1定位在细胞核和细胞膜。不同组织材料qRT-PCR分析表明，GhFUL1基因在茎尖中表达量最高。构建过表达载体转化拟南芥，结果表明，转基因拟南芥阳性株系中GhFUL1基因表达量显著增加，转基因株系的开花时间、花器官形态与野生型相比无明显变化，但是开花时侧枝数增加。qRT-PCR结果表明，细胞分裂素氧化/脱氢酶基因AtCTK1和AtCTK6表达量减少，推测GhFUL1基因可能通过调控细胞分裂素合成途径影响分枝。利用启动子分析网站PlantCARE预测可知，GhFUL1启动子区域不仅有TATA-box、CAAT-box核心元件，还有参与光响应、生长素响应以及胁迫应答等顺式作用元件。将GhFUL1启动子构建到表达载体pBI121检测其启动子活性，通过对拟南芥转基因阳性株系进行GUS染色，发现GhFUL1启动子在拟南芥幼苗期的茎尖分生组织和成熟期的花器官中特异性表达。初步揭示GhFUL1基因及其启动子转化拟南芥后在其分枝发育过程中具有一定的功能。

【目的】黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质。棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW(cotton resistance to Verticillium wilt)进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础。【方法】根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉(Gossypium hirsutum)农大601(ND601)中CRVW的开放读码框(open reading frame,ORF)。利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件。构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置。利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸(salicylic acid,SA)诱导处理条件下的表达模式。构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能。检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路。【结果】从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50%不规则卷曲、17.76%α-螺旋、11.20%延伸链和1.54%β-卷曲。综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质。CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高。CRVW的ORF上游序列(CRVW-P)中包括响应乙烯(ethylene)、SA、生长素(auxin)和脱落酸(abscisic acid)等4种激素信号的顺式作用元件。另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件。SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达。黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号(CCRI8)中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后。黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照(CK)组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症。进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性。沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1(isochorismate synthase 1)、EDS1(enhanced disease susceptibility 1)、PAD4(phytoalexin deficient 4)、NPR1(nonexpresser of PR gene 1)和PR1(pathogenesis-related protein 1)等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达。【结论】CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程。

[目的]本文旨在研究E3泛素连接酶基因的沉默对植物基础免疫及线虫寄生的影响,为揭示植物寄生线虫侵染寄主的分子机制提供理论依据。[方法]利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟E3泛素连接酶基因NbE3R14,用flg22处理基因沉默烟草叶片,RT-qPCR检测PTI(病原相关分子模式触发免疫,PAMPs-triggered immunity)相关基因的表达水平;接种辣椒疫霉于基因沉默烟草叶片,观察叶片病斑症状;采用室内人工接种法测定靶基因的沉默对南方根结线虫寄生的影响。[结果]RT-qPCR检测显示:农杆菌转化的烟草植株中NbE3R14基因已被成功沉默,flg22处理基因沉默烟草叶片激发的PTI相关基因GRAS2、WRKY7及WRKY8表达量分别下降41.3%、63.9%及61.8%,与野生型对照(WT)相比均有显著性差异(P<0.05),单卵块卵量则没有差异;而在TRV∷GFP处理植株上产生的根结数、雌虫数、卵块数以及单卵块卵量与WT均无明显差异。[结论]沉默NbE3R14基因能干扰植物基础免疫,从而导致烟草对辣椒疫霉及南方根结线虫的侵染更为感病。

【目的】研究油菜素类固醇物质(BRs)在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合,从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1849bp,包含一个1692bp的开放阅读框,推导编码563个氨基酸,与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性,具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强,在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比,无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型(WT)、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异(P

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过ＢｌＡＳＴ分析比对，从棉花ｅＳＴ数据库中获得１个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子ＧＴ－２亚家族，命名为ＧｈＧＴ－２。以棉花叶片总ｒＮＡ为模板，根据ｅＳＴ序列设计引物，利用ｒＴ－ＰＣｒ结合ｒＡＣｅ技术，获得ＧｈＧＴ－２的编码序列。使用ＭｅＧＡ５对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统．．．

根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3',5'-RACE技术,从棉花叶片中克隆出GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GDP-mannose-3',5'-epimerase,GME)基因,命名为GhGME。基因全长1 467 bp,开放阅读框1 131 bp,编码376个氨基酸,分子量为42.39 6 kDa,等电点pI=6.291。利用荧光定量Real-time RT-PCR方法对棉花根、茎、叶和3种处理下该基因的表达特性进行分析,结果表明,GhGME在根、茎中高水平表达,在叶中表达量较低。在4℃低温和200 mmol/L NaCl处理下该基因表达上调,然而用100μmol/L ...

ＳＯＣ１／ＴＭ３（ＳｕｐｐｒｅＳＳＯｒ Ｏｆ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅＳＳｉＯｎ Ｏｆ ＣＯｎＳＴａｎＳ １／ＴＯＭａＴＯ ＭａＤＳ－ｂＯｘ ｇｅｎｅ ３）是ＭａＤＳ－ｂＯｘ家族一员，它能够整合多条开花途径的开花信号，调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花成花转变过程的分子机理，采用ｒＴ－ｐＣｒ的方法从梅花长蕊绿萼中克隆到３个ＳＯＣ１的同源基因，分别命名为ｐＭ ＳＯＣ１－１、ｐＭ ＳＯＣ１－２和ｐＭＳＯＣ１－３，并采用荧光定量ｐＣｒ对３个基因的表达模式进行了分析。序列分析表明，３个基因的编码区长度分别为６４５ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－１）、６５４ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－２）和６６０ ｂｐ（ｐＭ．．．