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[期刊] 中国农业科学
[作者]
王俊娟 穆敏 王帅 陆许可 陈修贵 王德龙 樊伟丽 阴祖军 郭丽雪 叶武威 喻树迅
【目的】通过对棉花脱水素基因结构特征及其在低温胁迫下表达模式进行分析，探讨脱水素在棉花响应低温过程中的功能，为棉花抗冷育种提供理论基础。【方法】以棉花抗冷品种豫２０６７为试验材料，根据棉花陆地棉基因组序列查找已知脱水素（ｄｅｈｙｄｒｉｎ，ｄｈｎ）基因的ＣｄＳ序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计引物，克隆该基因，并命名为Ｇｈｄｈｎ１；采用生物信息学方法分析其蛋白质性质、氨基酸含量特征、功能结构域、系统进化树；选择ＸｂａⅠ和ＳｍａⅠ酶切位点对植物表达载体Ｐ ｂｉ１２１：：ＧＦＰ进行双酶切，采用ｉｎ－ＦｕＳｉｏｎ连接技术构建融合蛋白瞬时表达载体Ｐ ｂｉ１２１－Ｇｈｄｈｎ１：：ＧＦＰ；分析其在洋葱表皮细胞．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
乔慧蕾 王瑞刚 郭九峰 孙国琴 李国婧
为研究沙冬青脱水素的功能,根据沙冬青cDNA文库中脱水素基因序列设计引物,采用PCR技术进行了脱水素基因的扩增,扩增产物与载体pGM-T载体连接,转化大肠杆菌Top10,筛选阳性克隆,测序结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与已知沙冬青cDNA文库中脱水素基因大小一致,为760 bp,说明此序列无内含子。将成功克隆的阳性重组子提取质粒与pCAMBIA3301质粒同样进行酶切反应,再以T4DNA连接酶连接,成功构建了脱水素基因的植物表达载体,为下一步的抗逆性研究打下了基础。
关键词：
脱水素 克隆 植物表达载体 沙冬青
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
郭鹏 邢鑫 张万筠 姜健
以欧美杨为材料，通过ＲＴ－ＰＣＲ方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素ＤＨＮ２ｂ基因（命名为ＰＤＤＨＮ２ｂ），该基因开放阅读框为１４４０ ｂＰ，编码３７９个氨基酸，绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸，无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明ＰＤＤＨＮ２ｂ基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量ＰＣＲ分析表明：该基因在顶端中表达量最高，功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受ＮａＣｌ、ａｂａ和干旱等诱导表达。另外，构建了原核表达载体ＰＥＴＰＤＤＨＮ２ｂ，并在大肠杆菌ｂｌ２１中表达融合蛋白，诱导纯化后免疫小白鼠，制备抗体。ＳＤＳ－ＰａＧＥ电泳结果表明，融合蛋白分子量为５８ｋｕ。最后利用Ｎｉ－ＮＴａ纯化的ＰＤＤＨＮ．．．
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
郭鹏 邢鑫 张万筠 姜健
以欧美杨为材料,通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到了抗旱脱水素DHN2b基因(命名为PdDHN2b),该基因开放阅读框为1440 bp,编码379个氨基酸,绝大多数氨基酸组成属于亲水性氨基酸,无明显跨膜结构域。亚细胞定位表明PdDHN2b基因定位在细胞质或细胞膜上。荧光定量PCR分析表明:该基因在顶端中表达量最高,功能叶、根和茎中则无表达。同时该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。另外,构建了原核表达载体pETPdDHN2b,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,诱导纯化后免疫小白鼠,制备抗体。SDS-PAGE电泳结果表明,融合蛋白分子量为58ku。最后利用Ni-NTA纯化的PdDHN...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
陈婷婷 李旭凯 王如意 彭良才 夏涛
本研究旨在对棉花来源的果胶甲酯酶基因进行克隆和功能分析。通过RACE技术克隆了2个棉花果胶甲酯酶基因的cDNA,命名为GhPME1和GhPME2。序列分析发现:GhPME1和GhPME2的最大开放阅读框分别为1 704和1 752bp,分别编码含有567和582个氨基酸的蛋白质。蛋白质结构预测显示这2个蛋白结构相似,包含PMEI和Pectinesterase结构域。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果显示在陆地棉的纤维发育过程中,GhPME1和GhPME2的表达峰值分别在9和4DPA(开花后天数),然后依次降低。而在海岛棉纤维中,这2个基因的表达均呈现逐渐上升的趋势,表达峰值分别出现在开花后2...
关键词：
棉纤维 果胶甲酯酶 基因表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
贾荣荣 路莎莎 江媛 刘增平 俞嘉宁
【目的】克隆棉花蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose-phosphate synthase,SPS),并分析该基因在组织和纤维发育不同阶段及不同非生物胁迫下的表达模式。【方法】采用genome-walking及over-lap PCR方法,获得了棉花中一个蔗糖磷酸合成酶基因——GhSPS1,通过半定量PCR法检测GhSPS1在不同非生物胁迫条件下的表达模式,采用实时荧光定量PCR法对GhSPS1及GhSUS3、GhINV、GhCESA4进行组织和纤维发育特异性表达分析。【结果】克隆得到的GhSPS1全长4 545 bp,包含10个内含子、11个外显子,其开放读码框为3 108 bp,编码1 03...
关键词：
蔗糖磷酸合成酶 棉花 逆境胁迫 纤维发育
[期刊] 华北农学报
[作者]
赵曾强 李潇玲 张析 张薇 练文明
为了揭示棉花GhTGA1与GhTGA9. 2基因的生物学功能,利用RT-PCR技术,从抗枯萎病棉花品种中棉所12号中克隆了TGA转录因子基因GhTGA1与GhTGA9. 2。生物信息学分析表明,2个基因开放阅读框(ORF)长分别为1 281,1461 bp,分别编码405,486个氨基酸。序列分析表明,2个基因均含有b ZIP和DOG1结构域,属于b ZIP亚家族TGA转录因子基因。利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术进行表达特征分析表明,GhTGA1基因能被枯萎病菌、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)诱导上调表达,水杨酸(SA)诱导后,在各处理时间点,该基因表达量均低于Mock,以上结果表明,GhTGA1基因可能通过参与乙烯(ET)和茉莉酸(JA)信号通路调控棉花对枯萎病的抗性;枯萎病处理后,GhTGA9. 2基因在各时间点表达量均低于Mock,呈下调表达,但能被激素(ET、JA、SA)诱导上调表达。结果表明,GhTGA9. 2基因可能通过激素(ET、JA、SA)途径参与胁迫应答,通过对GhTGA1与GhTGA9. 2基因表达特征分析为后续研究提供基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗明 周建平 肖月华 李先碧 侯磊 肖忠意 裴炎
【目的】研究油菜素类固醇物质(BRs)在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合,从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1849bp,包含一个1692bp的开放阅读框,推导编码563个氨基酸,与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性,具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强,在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比,无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李晨宇 足木热木·吐尔逊 李晓荣 杨洋 李波 于月华
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用，而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值，因此，从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列，并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，通过Gataway BP和LR反应，将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件，最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示，GhMYB42(XP＿016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸，预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现，MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域，是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示，陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP＿012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显，因此，选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明，重组蛋白的大小正确，最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白，后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
龚文芳 喻树迅 宋美珍 范术丽 庞朝友 肖水平
【目的】克隆陆地棉抗细胞凋亡新基因GhDAD1,为陆地棉细胞凋亡的分子机制提供依据,为培育不早衰陆地棉品种提供理论基础。【方法】采用RT-PCR以及电子克隆获得陆地棉GhDAD1的基因组序列以及全长cDNA序列并进行生物信息学分析,然后通过荧光原位杂交(FISH)技术进行染色体定位,利用real-timePCR进行表达模式分析,分析6-BA、乙烯、H2O2、SA以及NO对GhDAD1表达量的影响。【结果】棉花GhDAD1编码阅读框全长354bp,包含5个外显子,4个内含子以及232bp的5′非编码区和280bp的3′非编码区。氨基酸序列分析表明,GhDAD1蛋白属于DAD家族,与柑桔、拟南芥G...
[期刊] 华北农学报
[作者]
罗岸 詹领
为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理，采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其ｃ ＤＮＡ文库，从中筛选到一个脱水素基因ＮｔＤＥＨ１。通过ＲＡｃＥ技术获得该基因全长，基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为６５１ ｂｐ的完整开放阅读框和一段５３５ ｂｐ的内含子，编码由２１７个氨基酸残基组成的蛋白质，其理论等电点为５．２７，属于酸性蛋白，且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与ＮｔＤＥＨ１蛋白非常类似的保守的同源序列，均具有ＳＫ２型脱水素特征。借助ＧＥＮｏｍＥ ｗＡｌＫｉＮＧ技术获取ＮｔＤＥＨ１基因约１ ７０．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
何鹏 黄圣 钱慧 俞嘉宁
【目的】从棉花中克隆2个新的PPR基因,分析其序列结构、基因表达和亚细胞定位,为深入研究这2个基因在棉花中的功能提供依据。【方法】利用棉花EST库,通过RT-PCR从陆地棉徐州142中克隆得到2个PPR基因:GhPPRH1和GhPPRH2;应用生物信息学方法对2个基因编码蛋白序列进行预测分析,利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法分析目的基因在不同组织及纤维不同发育时期的表达模式;利用棉花子叶瞬时表达系统对上述2个基因编码的蛋白进行亚细胞定位。【结果】GhPPRH1和GhPPRH2均属于PPR基因家族的PLS亚家族;GhPPRH1和GhPPRH2的开放读码框的长度分别为1 917和2...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王江英 张宁 司怀军 吴家和
根据棉花盐胁迫相关的EST序列设计特异性引物,利用3',5'-RACE技术,从棉花叶片中克隆出GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GDP-mannose-3',5'-epimerase,GME)基因,命名为GhGME。基因全长1 467 bp,开放阅读框1 131 bp,编码376个氨基酸,分子量为42.39 6 kDa,等电点pI=6.291。利用荧光定量Real-time RT-PCR方法对棉花根、茎、叶和3种处理下该基因的表达特性进行分析,结果表明,GhGME在根、茎中高水平表达,在叶中表达量较低。在4℃低温和200 mmol/L NaCl处理下该基因表达上调,然而用100μmol/L ...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王慧飞 冯雪 张一名 冯立峰 张瑜 陈光 孙艳香
为了深入研究棉花精氨酸酶基因对非生物胁迫的响应以及生理功能,利用电子克隆和RT-PCR技术从棉花中获得了精氨酸酶ORF序列Gh ARG1,盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA和MeJA处理棉花幼苗,并原核表达棉花精氨酸酶基因。生物信息学分析表明,其ORF序列长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,具有典型的精氨酸酶保守结构域。q RT-PCR技术分析表明,在叶片中该基因转录水平上受盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA处理的诱导,而对MeJA下调其表达。将Gh ARG1完整的编码序列融合到原核表达载体p Cold-TF中,经过IPTG诱导及SDS-PAGE检测表明,Gh ARG1编码产物的分子量约为37 ku,与预期相符。p Cold-Gh ARG1重组菌粗酶液中精氨酸酶活性是对照菌的6倍。研究表明,棉花内源性精氨酸酶基因Gh ARG1可能通过ABA、SA信号途径参与棉花对盐渍和干旱胁迫的响应,且其克隆表达产物具有精氨酸酶活性,为开展其生理功能研究奠定了基础。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘丽 赵鹏 王丹 刘正杰 王玉美 华金平
【目的】克隆棉花脂肪酸合成碳链延长的3个重要基因,分析它们的基因表达及其对逆境胁迫的反应,为棉花高油分育种和抗逆育种提供候选基因。【方法】采用同源克隆的方法,克隆陆地棉脂肪酸合成碳链延长3个重要基因GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长;应用生物信息学方法,分析克隆基因编码蛋白的特性;通过RT-PCR,分析目标基因的组织表达特征、时空表达水平和非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】GhKAR和GhENR属于NADB Rosemann超基因家族,GhHAD属于hotdog超基因家族;GhKAR、GhHAD和GhENR的cDNA全长分别为1 119、906和1 318 bp,分别编码283...
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