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[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨郁文 周建武 高媛媛 陈天子 张保龙 倪万潮
【目的】克隆棉花烟酰胺合成酶基因及其启动子,明确其表达特征,分析其在转基因育种中的应用前景。【方法】根据对一个棉花Maxxa BAC克隆(78L16)的测序结果,首先从海岛棉品种海7124中PCR扩增获得了棉花烟酰胺合成酶基因GbNocotin的启动子序列,并利用网上数据库PLACE对该序列进行调控元件的预测分析。其次构建该启动子与GUS连接的重组载体pGbNocotin::GUS,并通过花浸染法转化拟南芥并获得转基因植株,分别在幼苗期和成熟期对转基因植株进行GUS染色分析。然后通过RT-PCR获得GbNocotin的开放阅读框(ORF)序列,并利用Mega5.0对GbNocotin进行进化树...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张晓红 许佩阳 闫绪 张贝贝 于婵婵
为探究GhFUL1基因在棉花分枝发育进程中的功能，从棉花中克隆MADS-box家族GhFUL1基因及其启动子，对该基因进行功能研究，并对其启动子进行活性分析。结果表明，棉花中GhFUL1基因开放阅读框726 bp,编码241个氨基酸。进化树分析表明，GhFUL1与其他物种中可可的TcAGL8-1亲缘关系最近。烟草亚细胞定位分析结果表明，GhFUL1定位在细胞核和细胞膜。不同组织材料qRT-PCR分析表明，GhFUL1基因在茎尖中表达量最高。构建过表达载体转化拟南芥，结果表明，转基因拟南芥阳性株系中GhFUL1基因表达量显著增加，转基因株系的开花时间、花器官形态与野生型相比无明显变化，但是开花时侧枝数增加。qRT-PCR结果表明，细胞分裂素氧化/脱氢酶基因AtCTK1和AtCTK6表达量减少，推测GhFUL1基因可能通过调控细胞分裂素合成途径影响分枝。利用启动子分析网站PlantCARE预测可知，GhFUL1启动子区域不仅有TATA-box、CAAT-box核心元件，还有参与光响应、生长素响应以及胁迫应答等顺式作用元件。将GhFUL1启动子构建到表达载体pBI121检测其启动子活性，通过对拟南芥转基因阳性株系进行GUS染色，发现GhFUL1启动子在拟南芥幼苗期的茎尖分生组织和成熟期的花器官中特异性表达。初步揭示GhFUL1基因及其启动子转化拟南芥后在其分枝发育过程中具有一定的功能。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孟红岩 杜雄明 张春义 范云六 姜凌
【目的】从棉花无短绒突变体GZnn中分离棉纤维发育相关的转录因子,并对其转录激活功能和表达模式进行初步分析。【方法】通过RACE(rapid amplification of the cDNA ends)和染色体步行(genome walking)技术,获得GhMS3的cDNA序列及基因组DNA序列。利用生物信息学方法对获得的DNA序列及推定的氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交系统验证GhMS3蛋白的转录激活功能,运用GUS组织化学染色法在转基因烟草中分析该基因的表达模式。【结果】获得GhMS3的基因组DNA以及上游1174bp的启动子序列。氨基酸序列比对发现GhMS3是R2R3 MYB转录因...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郑建树 喻春明 陈平 王延周 谭龙涛 陈继康 朱涛涛 卢凌霄 朱娟娟 段叶辉 熊和平
【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
蒋瑶 戚晓利 赵树堂 卢孟柱
为了分析AP1的表达调控模式,本研究克隆了拟南芥花异常株系AFDL的AP1启动子,启动子元件预测结果表明:AP1启动子中含有3个结合MADS调控因子的CArG box(从5'依次编号为CArG1、CArG2、CArG3),通过删减AP1启动子长度以及改变CArG box数量构建了5个GUS表达载体并转化野生型拟南芥。测序结果显示:AFDL的AP1启动子在核苷酸序列上与野生型拟南芥完全一致,这表明AP1在AFDL中的表达显著降低并不是启动子序列突变引起的;转基因植株的GUS表达模式说明了CArG1在花发育早期及后期激活基因的表达,CArG2在整个后期都对基因的表达有抑制作用,而CArG3在花发育...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王丹 刘骉 胡兆农 吴文君 肖新敏 师宝君
【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分
[期刊] 西南农业学报
[作者]
郑苗苗 池玉杰 邵淑丽 姜秋旭
本文以优化后的漆酶培养基为基础,运用RT-PCR和RACE技术相结合,从该菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2105 bp。比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子。cDNA序列全长为1873 bp,其中,包含一个完整的ORF,长度为1563 bp,编码520个氨基酸。序列在氨基酸水平上与偏肿革裥菌Lenzites gibbosa的相似性评价最高,相似性达70%。采用FA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长800 bp的启动子序列。该启动子区域上除分布有TATA...
关键词：
灰树花 漆酶基因 启动子克隆 转录调控
[期刊] 中国农业科学
[作者]
雷建峰 伍娟 陈晓俊 於添平 倪志勇 李月 张巨松 刘晓东
【目的】以棉花品种新海16基因组DNA为模板,克隆海岛棉(Gossypium barbadense L.)Gb U6启动子,筛选出能在棉花生殖细胞中(花粉)高效转录的Gb U6启动子,为利用基因组编辑技术进行棉花分子育种奠定重要基础。【方法】采用两轮PCR方法克隆完整的Gb U6启动子。根据网上公布的棉花基因组数据库序列,利用Primer5.0软件设计5对引物,进行第一轮能覆盖完整Gb U6启动子的PCR扩增,产物克隆测序正确后,再利用transfer PCR法将Gb U6启动子精确亚克隆到CRISPR/Cas9基因组编辑载体中;第二轮扩增产物测序正确后,运用DNAMAN软件对克隆成功的5个G...
[期刊] 华北农学报
[作者]
晁毛妮 张志勇 张金宝 温青玉 郭书磊 马亮 王清连
为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一
[期刊] 水产学报
[作者]
卢志杰 叶成凯 Sarath Babu V 张晓君 刘晓丹 赵丽娟 潘淦 林蠡
谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏>肌肉>胃>肠>鳃>心脏>脑>血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑>鳃>胃>肠>肌肉>心脏>血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。
关键词：
罗氏沼虾 谷氨酰胺合成酶 组织表达 蜕壳
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
叶浩田 郑美霞 孙彩霞 赵光武
为研究ZmMYB59基因启动子的表达模式,以玉米自交系‘B73’幼苗基因组DNA为模板,克隆ZmMYB59基因2个启动子片段分别命名为MYB59-P-1、MYB59-P-2,构建GUS植物表达载体pCXGUS-MYB-1K,pCXGUS-MYB-2K,并通过农杆菌介导法转化水稻‘日本晴’获得GUS植物表达载体转基因植株。通过PlantCARE软件进行生物信息学分析,发现ZmMYB59基因启动子中具有ABRE和CCGTCC-box等重要的顺式作用元件。GUS染色结果显示:1)pCXGUS-MYB-1K的种子没有着色,表明其未驱动GUS在种子中表达,pCXGUS-MYB-2K的种子胚乳边缘着色,表明其驱动的GUS在种子胚乳边缘表达;2)种子萌发期pCXGUSMYB-1K只有芽尖着色,表明其仅驱动GUS在芽尖表达,pCXGUS-MYB-2K芽尖和根均着色,芽尖着色较深,根维管束细胞少量着色,表明其驱动的GUS主要在芽尖表达,而在根部维管束组织中表达较弱;3)苗期pCXGUSMYB-1K,pCXGUS-MYB-2K植株的根、茎、叶均能着色,但后者着色较深,表明ZmMYB59基因的启动子可能是组成型启动子,同时也说明MYB59-P-1是启动子发挥正常调控功能所必须的,但启动能力不强,推测MYB59-P-2中可能存在增强启动子表达的顺式作用元件。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
叶凌凤 刘琳 张志高 徐启来 王俊仁 康定明
为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time P
[期刊] 中国农业科学
[作者]
卞书迅 韩晓蕾 袁高鹏 张利义 田义 张彩霞 丛佩华
【目的】U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异。迄今在苹果(Malus×domestica)上对U6启动子尚缺乏研究。因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。【方法】利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase,LUC)的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较。【结果】苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA(E-value
[期刊] 西南农业学报
[作者]
孙雪梅 宗渊 杨世鹏 王丽慧 刘宝龙 张怀刚
【目的】本文分离了菊芋蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶(1-SST)基因的启动子并验证其功能。【方法】通过Tail-PCR方法克隆到菊芋1-SST基因起始密码子上游约1816 bp的序列(SSTP),并通过PLANTCARE对SSTP序列进行了功能预测。【结果】SSTP序列中共检测到140个顺式作用元件,除启动子所具有的44个TATA-box和31个CAAT-box等基本元件之外,还有65个参与1-SST基因表达调控的顺式作用元件,其中23个顺式作用元件可预测其功能:参与光调控过程的调控元件有13个,参与脱落酸、厌氧过程、低温胁迫的调控元件各2个,参与水杨酸、抗逆反应、分生组织表达和胚乳表达的调控元件各1个。分别用SSTP、1/2SSTP和1/4SSTP的序列替换pCAMBIA1301载体的CaMV 35S启动子后,在烟草叶片中进行瞬时表达并进行GUS染色,结果表明不同长度的SSTP序列均具有驱动GUS基因表达的启动子活性,且与CaMV35S启动子活性相当。【结论】据此推测1-SST基因的启动子核心区域在起始密码子上游400 bp以内。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
罗明 周建平 肖月华 李先碧 侯磊 肖忠意 裴炎
【目的】研究油菜素类固醇物质(BRs)在棉花纤维生长发育过程中的作用。【方法】通过棉花EST序列的筛选和整合,从陆地棉徐州142纤维中克隆了一个BRs合成酶基因GhDWF1。【结果】其cDNA序列全长1849bp,包含一个1692bp的开放阅读框,推导编码563个氨基酸,与水稻、玉米、豌豆、番茄和拟南芥的BRs合成酶DWARF1/DIMINUTO有较高的同源性,具有该类蛋白的典型结构。GhDWF1基因在开花当天的胚珠和纤维中表达最强,在根、幼茎和纤维发育的各个时期表达较高。与徐州142野生型相比,无绒无絮突变体胚珠中表达量较低。【结论】暗示GhDWF1基因的表达与棉花纤维的生长发育有密切关系。
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