【目的】挖掘、分析响应干旱诱导的MYB转录因子的功能,为棉花抗旱研究和育种提供参考。【方法】以已知受干旱诱导表达的Gb MYB5为检索项,BLASTX检索NCBI的非冗余蛋白nr数据库中与Gb MYB5具有相似序列的棉花MYB转录因子,通过荧光定量PCR验证获得干旱应答相关的MYB转录因子Gh RAX3。将Gh RAX3-GFP融合蛋白表达载体通过农杆菌注射法在烟草叶片瞬时表达,观察亚细胞定位荧光信号。将棉花曲叶病毒CLCr V介导的基因沉默载体CLCr V﹕Gh RAX3通过农杆菌浸润法注射棉花子叶,荧光定量PCR检测棉花Gh RAX3表达水平,对Gh RAX3沉默的棉花植株进行干旱胁迫处理...

【目的】在已有的一条紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)盐诱导未知基因的EST序列基础上,克隆其(MsHB2)全长序列并分析其功能,以进一步了解其在紫花苜蓿中的耐盐调控机理。【方法】以先前获得的EST序列为基础设计引物,使用RACE法从紫花苜蓿中克隆得到MsHB2的3′和5′末端序列,经DNAMAN软件拼接后得到其全长序列。使用多种生物信息学软件对MsHB2的开放阅读框,编码蛋白等电点、分子量、疏水性、亚细胞定位、进化关系等进行预测分析。构建MsHB2的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将MsHB2与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位...

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过ＢｌＡＳＴ分析比对，从棉花ｅＳＴ数据库中获得１个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Ｔｒｉｈｅｌｉｘ转录因子ＧＴ－２亚家族，命名为ＧｈＧＴ－２。以棉花叶片总ｒＮＡ为模板，根据ｅＳＴ序列设计引物，利用ｒＴ－ＰＣｒ结合ｒＡＣｅ技术，获得ＧｈＧＴ－２的编码序列。使用ＭｅＧＡ５对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统．．．

分析棉花盐胁迫相关的EST文库,设计特异性引物,利用RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase,MDH)基因,命名为GhMDH。基因全长1 130 bp,最大开放阅读框1 014 bp,编码338个氨基酸,分子量为35.495 kDa,等电点pI=8.94。将该基因编码区插入到原核表达载体pET23b中,获得pET23b-GhMDH重组载体。利用IPTG诱导表达目标蛋白,发现通常条件下获得的重组蛋白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度等条件进行优化,结果表明,除了在28℃低温以下诱导的蛋白有少量为可溶,其他条件诱导的蛋白均以包涵体形式存在。为了...

基于棉花体细胞胚胎再生不同时期表达谱中筛选出一系列差异表达转录因子,通过RT-PCR和qRT-PCR分析这些转录因子在不同逆境处理下的表达,发现GhSEDEG38基因(somatic embryogenesis differencially expressed gene 38)的表达受盐胁迫诱导明显上调;序列分析发现GhSEDEG38编码bZIP型转录因子,与拟南芥bZIP53基因同源。为进一步验证该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,通过分子检测获得了表达量显著降低的转基因棉花株系。通过对萌发期和三叶期转基因材料和对照材料进行盐处理发现,干涉GhSEDEG38基因降低棉花在萌发期及苗期对盐胁迫的抗性,盐处理后转基因植株的MDA含量和活性氧含量显著高于对照材料,而可溶性糖含量显著低于对照材料。综上,GhSEDEG38参与棉花对盐胁迫的应答。

【目的】MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子MoIsw2对稻瘟病菌的生长发育和致病性至关重要。为了深入理解MoIsw2的作用机制，对其调控的稻瘟病菌基因进行鉴定和功能分析。【方法】对野生型稻瘟病菌菌株Ku80和突变体ΔMoisw2进行RNA-seq分析，选择突变体中表达发生明显变化的7个基因（MoEGH16L1、MoEGH16L2、MoSTART1、MoGH61A、MoCTR1、MoFRO1和MoGH31A）作为MoIsw2的候选调控基因，通过基因敲除对其表型和致病性进行分析。【结果】RNA-seq分析表明，突变体ΔMoisw2中差异表达的基因主要涉及氧化还原、细胞膜合成、氨基酸代谢和基因组DNA修复等过程。7个候选调控基因的敲除试验表明，这些基因在稻瘟病菌的营养生长、孢子发育和致病过程中发挥重要作用，各基因突变体表型与突变体ΔMoisw2均具有相似之处。【结论】MoIsw2通过调控多个靶基因参与稻瘟病菌的生长发育和致病过程。

【目的】从棉花无短绒突变体GZnn中分离棉纤维发育相关的转录因子,并对其转录激活功能和表达模式进行初步分析。【方法】通过RACE(rapid amplification of the cDNA ends)和染色体步行(genome walking)技术,获得GhMS3的cDNA序列及基因组DNA序列。利用生物信息学方法对获得的DNA序列及推定的氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交系统验证GhMS3蛋白的转录激活功能,运用GUS组织化学染色法在转基因烟草中分析该基因的表达模式。【结果】获得GhMS3的基因组DNA以及上游1174bp的启动子序列。氨基酸序列比对发现GhMS3是R2R3 MYB转录因...

【目的】对紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhongmu-1)stress-induced protein kinase gene 1(Ms SIK1)进行克隆与表达研究,了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板,根据同源克隆设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得Ms SIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)模拟该基因的蛋白结构。构建Ms SIK1的亚细胞定位瞬时表达载体,使用基因枪转化法将Ms SIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并...

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型(WT)、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异(P

【目的】黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质。棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW(cotton resistance to Verticillium wilt)进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础。【方法】根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉(Gossypium hirsutum)农大601(ND601)中CRVW的开放读码框(open reading frame,ORF)。利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件。构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置。利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸(salicylic acid,SA)诱导处理条件下的表达模式。构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能。检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路。【结果】从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50%不规则卷曲、17.76%α-螺旋、11.20%延伸链和1.54%β-卷曲。综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质。CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高。CRVW的ORF上游序列(CRVW-P)中包括响应乙烯(ethylene)、SA、生长素(auxin)和脱落酸(abscisic acid)等4种激素信号的顺式作用元件。另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件。SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达。黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号(CCRI8)中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后。黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照(CK)组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症。进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性。沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1(isochorismate synthase 1)、EDS1(enhanced disease susceptibility 1)、PAD4(phytoalexin deficient 4)、NPR1(nonexpresser of PR gene 1)和PR1(pathogenesis-related protein 1)等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达。【结论】CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程。

为研究棉花ＮＡＣ转录因子基因ＧｈＳＮＡＣ３启动子的结构和功能，以鲁棉研３２号基因组为模板，用ＰＣＲ扩增的方法得到棉花基因ＧｈＳＮＡＣ３的启动子序列，利用分析网站ＰｌＡＮｔＣＡＲＥ、ＰｌＡＣＥＲ和ＢＤＧＰ对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析，在此基础上利用该启动子及ＧｈＳＮＡＣ３基因构建植物表达载体，并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明ＧｈＳＮＡＣ３启动子除含有ＣＡＡｔ－Ｂｏｘ等基本顺式作用元件外，还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析，结果显示ＧｈＳＮＡＣ３在盐胁迫下植株根部．．．

[目的]RING(really interesting new gene) finger E3泛素连接酶在植物生长发育和抵御环境胁迫中具有重要作用。克隆棉花RING finger E3泛素连接酶基因GhRING1-like并分析其表达特征和功能,为该基因分子作用机制研究和育种应用奠定基础。[方法]根据棉花表达谱分析,选取并克隆干旱胁迫处理上调表达基因GhRING1-like,qRT-PCR分析GhRING1-like的组织表达特性及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式;采用瞬时表达对GhRING1-like-GFP融合蛋白进行亚细胞定位分析;通过获得病毒介导的基因沉默(VIGS)棉花和过表达拟南芥植株,分析沉默或过表达GhRING1-like对植株生长发育及其抗旱性的影响。[结果]GhRING1-like基因序列全长996 bp,编码332个氨基酸,其C端含有RING-H_2(C3H_2C3)结构域。GhRING1-like定位于内质网上。GhRING1-like在叶片中优势表达; 200 g·L~(-1)PEG6000诱导处理1 h后瞬时显著上调表达12倍; GhRING1-like对Na Cl、ABA和SA的响应时间都在处理后3 h,上调表达均在5倍左右。干旱胁迫处理后,VIGS沉默GhRING1-like棉花叶片相对含水量和叶绿素荧光参数Fv/Fm分别较未沉默对照降低17.1%和30.6%,而电解质渗透率和丙二醛含量分别较对照提高70.8%和100%。过表达GhRING1-like显著提高了拟南芥种子萌发和幼苗期对于甘露醇引起的渗透胁迫的耐受性;可使营养生长中后期阶段的拟南芥在水分亏缺处理下的存活率提高2.4倍;转基因拟南芥叶片气孔开度降低51.2%,失水率明显降低。干旱胁迫下,过表达GhRING1-like使依赖于ABA诱导表达的At AREB1、At ERD15、AtRD29A上调表达,而对不依赖ABA的干旱胁迫诱导基因At DREB和脯氨酸合成基因At PLD没有影响。[结论]棉花GhRING1-like参与了植物非生物胁迫抗性的调控,主要通过依赖于ABA通路正向调控植物的抗旱反应。

【目的】分离GsSNARE1,并分析其耐逆功能,为深入研究GsSNARE1功能及分子机制奠定基础。【方法】以耐盐野生大豆G50109为材料,利用酵母双杂交验证GsSNARE1与GsCBRLK的互作关系,通过real-time PCR分析干旱和盐处理后GsSNARE1的表达特性,对GsSNARE1进行原核表达,分析GsSNARE1抗盐旱功能。【结果】获得与GsCBRLK互作的GsSNARE1,同源克隆其全长CDS,并在酵母体内验证了二者的相互作用;Real-time PCR分析表明GsSNARE1受盐、干旱胁迫诱导,经PLACE分析,发现其启动子中含有多个逆境胁迫相关的顺式作用元件;GsSNAR...

[目的]研究TETRASPANIN3基因在抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病中的作用及对番茄生长发育的影响。[方法]通过软件MEG5.0构建进化树,分析TETRASPANIN3基因的进化;采用荧光定量PCR检测TETRASPANIN3在番茄各个器官中的表达量及对TYLCV诱导的响应;通过病毒诱导的基因沉默技术(VIGS),将番茄中的TETRASPANIN3沉默,测定基因沉默后番茄的抗病性并观测沉默植株表型。[结果]番茄的TETRASPANIN3基因与葡萄VITIS VINIFERA基因在一个独立的进化分支上;TETRASPANIN3基因在各器官中均有表达,在茎、老叶、花中表达量较高,在根、果实...

［目的］本文旨在研究ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３基因在抗番茄黄化曲叶病毒（ｔＹＬＣＶ）病中的作用及对番茄生长发育的影响。［方法］通过ＭｅＧ ５．０软件构建进化树，分析ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３基因的进化；采用实时荧光定量ｐＣｒ（ｒｔ－ｑ ｐＣｒ）检测ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３在番茄各个器官中的表达量及对ｔＹＬＣＶ诱导的响应；通过病毒诱导基因沉默技术（ＶｉＧｓ）将番茄中的ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３沉默，测定基因沉默后番茄的抗病性并观测沉默植株表型。［结果］构建的进化树显示：番茄的ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３基因与葡萄同源基因在一个独立的进化分支上。ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ３基因在各器官中均有表达，在茎、老叶、花．．．