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[期刊] 西南农业学报
[作者]
蒋文灿 郑林英
为了快速诊断和检测鸭肿头败血症病毒抗原,用分离自典型鸭肿头败血症的XD株病毒,制备鸭抗XD IgG、兔抗XD IgG,建立了检测鸭肿头败血症病毒(DSHSV)抗原的间接夹心ELISA法。试验的最佳条件为:抗体包被量为8μg/mL,封闭液为0.5%明胶,抗原孵育条件为37℃1.5 h,兔抗XD病毒IgG浓度5μg/mL,酶标羊抗兔抗抗体浓度为1∶2000,洗涤液为0.02 mol/LpH7.2 PBS。阴阳性结果判定的临界OD值为0.412。重复性试验显示变异系数小于10%。建立的间接夹心ELISA法不与鸭肿头败血症阴性抗原、鸭大肠杆菌抗原、鸭瘟抗原、鸭肝炎病毒抗原呈现交叉反应。敏感性比琼脂扩散...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张舍郁 程安春 汪铭书 沈婵娟 李传峰
【目的】建立间接免疫荧光(IFA)检测石蜡切片中鸭肿头出血症病毒(DSHDV)的方法,为DSHDV感染的实验室诊断、DSHDV在感染鸭组织细胞中的亚细胞定位和动态研究提供有效的检测手段。【方法】用差速离心纯化DSHDV,将纯化DSHDV免疫家兔制备兔抗DSHDV高免血清,并以DEAE-SephadexA-50柱层析纯化出兔抗DSHDVIgG,建立IFA检测石蜡切片中DSHDV的方法;利用建立的IFA对28日龄鸭人工感染DSHDV死亡鸭不同组织器官以及临床样品进行检测。应用PAGE电泳分析DSHDV基因组特性。【结果】IFA最佳条件为:切片在0.01mol·L-1柠檬酸(pH6.0)缓冲液微波修...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
苏小东 曹瑞兵 张羽 刘文娟 陈昊 祝长青 陈溥言
鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
张琳琳 连科迅 张英 蒋烨 姜艳萍 崔文 乔薪瑗 唐丽杰 李一经 刘敏
以纯化的兔抗传染性胰坏死病病毒(IPNV)VP2重组蛋白多克隆抗体为包被抗体,抗IPNV VP2单克隆抗体为检测抗体建立了IPNV双抗体夹心ELISA方法。优化反应条件为:兔抗IPNV VP2重组蛋白多克隆抗体包被浓度为1.28μg/mL,抗IPNV VP2单克隆抗体的工作浓度为1.34μg/mL,酶标二抗稀释比例为1∶2 000,以P/N>2,且OD490 nm>0.101 494作为阳性判定标准。该方法的重复性变异系数均小于10%,与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、轮状病毒(HRV)无交叉反应。对41份虹鳟肝脏样品分别进行...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李坤 温国元 罗青平 商雨 艾地云 罗玲 王红琳 杨峻 邵华斌 程国富
建立了检测猪圆环病毒2型血清抗体的间接ELISA方法,并初步应用于临床血清样品的检测。用PCR方法从PCV2 HBZX株中获得截短的核衣壳(capsid,Cap)基因,将该基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-Cap,将该重组质粒转化宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3),用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定蛋白的正确表达,表达蛋白Cap分子质量为42 ku,可与6×HIS抗体反应;KCl预染切胶纯化目的蛋白,以其为抗原建立检测PCV2感染猪血清抗体的间接ELISA方法。ELISA检测5份血清样品结果变异系数均小于10...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘礼辉 张德锋 李宁求 付小哲 林强 石存斌
【目的】建立可同时快速检测斑点叉尾鮰败血症３种病原（嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华菌）的多重ＰＣＲ检测方法。【方法】根据嗜水气单胞菌溶血素基因（Ｈｌｙ）、维氏气单胞菌脱氧核糖核酸酶Ⅰ基因（ＤＮａｓｅⅠ）以及鮰爱德华菌溶血活化基因（ｅＨａ）的保守序列，设计３对特异性引物，优化并建立斑点叉尾鮰败血症３种主要病原菌的多重ＰＣＲ方法，对其特异性和灵敏度进行考察，并将其用于临床样品的检测。【结果】建立的多重ＰＣＲ方法，当Ｈｌｙ基因、ＤＮａｓｅⅠ基因以及ｅＨａ基因的引物浓度分别为１．０，１．０和０．５μｍｏｌ／ｌ，退火温度为５９．５℃时，各目的片段均可较好地扩增。特异性试验结果表明，建立的多重ＰＣＲ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
苗得园 杨兵 李富强 张培君 龚玉梅 李永清 付磊 高配亮
在伪狂犬病病毒种特异性单克隆抗体的基础上建立了检测该病毒抗原的单抗夹心LAB -ELISA方法。结果表明 ,该方法不与其他常见病原体产生交叉反应 ,抗原的最低检出含量为 8 9μg/mL。检测时最佳采样部位是猪脑及扁桃体。对人工感染兔、自然感染猪以及临床可疑病猪的检出率分别为 75% ,75%及 72 7% ,因此本方法是一种具有良好特异性及较好敏感性的诊断方法。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
孙学强 金业 陆承平
用纯化的河蟹“颤抖病” (暂定名 )病毒分别免疫家兔和山羊 ,制备高效价的抗血清。羊抗血清经硫酸铵盐析纯化。经方阵滴定 ,选择P/N =2 95时作 1∶10 0稀释的抗血清为工作浓度 ,建立ELISA双抗体夹心法检测样本 14 4份 ,包括来自长江水域的野生河蟹、人工感染发病的河蟹、 1999年和 2 0 0 0年从江苏采集的自然发病的病蟹及市场购买河蟹。结果显示 ,病蟹和市场购买河蟹的阳性率为 6 6 7%～ 10 0 % ,人工感染的病蟹和人工感染石蟹致病组阳性率均为 10 0 % ,来自长江水域的健康河蟹及未接种病毒的对照石蟹阳性率均为 0 ,表明建立的方法可以用于检测河蟹“颤抖病...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
杨增岐 祝卫国 王旭荣 张涌
应用PCR扩增得到猪2型圆环病毒ORF2基因的3′端约600 bp,该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并分别在其上下游添加Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点。PCR产物用Kpn Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切后,与经同样处理过的 pBAD/g Ⅲ B Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示1条约28 ku的目的条带, 纯度达到85％以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了PCV2的间接ELISA检测方法。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
何介华 邹思湘 陆承平
纯化团头鲂抗病毒半乳糖凝集素样蛋白并自制其兔抗血清 ,在此基础上建立间接ELISA ,测定团头鲂血清中的半乳糖凝集素样蛋白的含量。结果表明 ,血清中的平均含量为 0 79mg·mL-1;团头鲂血清及纯化的团头鲂半乳糖凝集素样蛋白抗草鱼出血病病毒效价分别为 5 12和 12 8,二者中和指数分别为 4 5 7和 177。所建立的方法与经典的中和试验有较好的平行关系
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李琼 岳志芹 凌宗帅 刘荭 梁成珠 陈晓 陈昌福
根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
程安春 廖永洪 朱德康 汪铭书 罗启慧 贾仁勇 陈孝跃
【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋帅 李春玲 臧莹安 郭海祥 李淼 杨冬霞 徐志宏
为了建立一种准确、快速的副猪嗜血杆菌病原夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，以副猪嗜血杆菌外膜蛋白Ｐ５的特异性单克隆抗体１Ｅ２作为捕获抗体，兔抗副猪嗜血杆菌多克隆抗体作为检测抗体，通过方阵滴定优化夹心ＥＬＩＳＡ检测方法最佳反应条件，并对该检测方法进行特异性、敏感性验证以及临床样品的检测应用。结果显示，该检测方法中单克隆抗体１Ｅ２最佳包被浓度为３．４３４μｇ／ｍ Ｌ，兔抗副猪嗜血杆菌多抗的最佳稀释浓度为３．３５０μｇ／ｍ Ｌ，用１０ ｍｇ／ｍ Ｌ明胶３７℃封闭１ ｈ优于其他封闭液，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多体最佳使用浓度为１∶４ ０００。该检测方法的特异性试验结果显示可检测出１５个血清型的副猪嗜血杆菌病．．．
关键词：
副猪嗜血杆菌 单克隆抗体 夹心ELISA
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
闫瑞杰 张云飞 刘玲玲 张红垒 王亚宾 胡慧
【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。
[期刊] 华北农学报
[作者]
顾昀 周晓丽 袁秀芳 杜晓莉 徐丽华 李军星 方维焕 王一成
为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复...
关键词：
猪流行性腹泻病毒 重组N蛋白 ELISA
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