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[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
施少华 陈红梅 程龙飞 傅光华 万春和 黄瑜
以禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)C48-1为研究对象,利用LAMP方法对Pm进行快速检测.结果表明:LAMP方法在恒温65℃下,1 h内就可以检测到Pm;LAMP方法最低可检测100 pg.μL-1Pm基因组DNA.该方法不需要精密的温度循环装置,有恒温加热设备就可以满足检测条件,适合基层临床应用.
关键词：
禽多杀性巴氏杆菌 环介导等温扩增方法
[期刊] 中国水产科学
[作者]
翟立文 刘文枝 许晨 范玉顶 江南 周勇 曾令兵
本研究针对鲤浮肿病病毒(carp edema virus, CEV)基因组核蛋白编码基因P4a的序列,设计2对特异性引物,以克隆构建的重组质粒为标准模板,通过优化反应体系中引物浓度组合、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、反应温度和扩增时间等参数,建立了CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。结果表明,CEV-LAMP方法的最佳反应温度为62℃,引物浓度组合为引物F3/B3 0.2μmol/L,引物FIP/BIP 1.2μmol/L, Betaine0.7 mol/L, Mg~(2+) 8.0 mmol/L, dNTPs 1.2 mmol/L,反应时间60 min。反应产物经凝胶电泳呈现梯型条带,添加SYBR Green I荧光染料后,呈现明显的绿色阳性反应。CEV-LAMP法灵敏度高,最低检测限为10 copies/μL,较常规PCR法灵敏度高100倍; CEV-LAMP法特异性强,与锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)、鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)无交叉反应。CEV-LAMP应用于患病鲤样本检测结果准确,简便快速,可为鲤浮肿病的现场诊断与防控提供技术支撑。
[期刊] 水产学报
[作者]
曲朋 王崇明 任伟成 梁彦韬 贾志磊 黄倢 潘鲁青
奥尔森帕金虫是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、灵敏、准确和使用简便的检测方法,实验根据奥尔森帕金虫5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribedspacer,ITS)序列,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应温度、反应体系中Mg2+浓度和反应时间进行了优化。该方法的检测灵敏度约为30拷贝质粒DNA,并且特异性较强,与海水帕金虫、包纳米虫、波豆虫及急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)等病原均无交叉反应。使用LAMP法对两...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李琼 岳志芹 凌宗帅 刘荭 梁成珠 陈晓 陈昌福
根据淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守序列,利用PrimerExplorer 3软件设计了5条引物,对LAMP反应温度和反应时间等参数进行了优化。与流行性造血器官坏死病毒、虎纹蛙病毒、蛙虹彩病毒、新加坡石斑虹彩病毒、鳜传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒等其它虹彩病毒及对虾白斑综合症病毒都没有交叉反应。将LAMP检测方法与常规PCR进行灵敏度的比较分析,结果显示LAMP的检测灵敏度约为15 fg,比常规PCR灵敏度高一个数量级。该方法检测时间短,在1 h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明12尾外观有淋巴囊肿病症状的...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
席伟军 李江红 陈大福 梁勤
【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（ＡｓｃｏｓｐｈＡｅｒＡ Ａｐｉｓ）的环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｌＡｍｐ）方法，为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。［方法］根据蜜蜂球囊菌特异性序列ｉｔｓ区，用在线引物设计软件ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４．０设计并合成４条特异性引物Ａ．Ａｐｉｓ－ｆ３（５＇－ＡｃＡｔｔＧｃＧｃｃｃｔｃｔＧＧｔＡ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－Ｂ３（５＇－ｔＧＧｔｔＡＧＡｃｃＧＧＡｃＡＧｔｃＧ－３＇）、Ａ．Ａｐｉｓ－ｆｉｐ（５＇－ｔＡＡＧＡｃＧＧＧＡｃＧＡｔｃＧｃｃｃ ＡＡｃｃｔＧｔｃｃＧＡＧｃＧｔｃＡｔｔ．．．
[期刊] 华北农学报
[作者]
许紫建 杨兵 苏霞 周宏专 史爱华 徐福洲
首先根据空肠弯曲菌mapA基因序列设计LAMP引物,建立检测空肠弯曲菌的LAMP检测方法。继而对LAMP方法中不同反应组分的浓度分别进行筛选,结果显示,当内外引物浓度分别为1.6,0.2μmol/L、Mg2+浓度为8mmol/L、dNTP浓度为1.4 mmol/L、Betaine浓度为0.8 mol/L时获得最佳的反应结果。最后对LAMP反应的特异性和敏感性进行检测,特异性检测结果显示,对其他13种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌扩增结果均为阴性;敏感性检测结果显示,对空肠弯曲菌基因组DNA的检测限为每个反应管100 fg,对空肠弯曲菌培养菌液检测限为每个反应管7.5cfu。试验建立的LAMP方法为...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
张金凤 曾令兵 张辉 周勇 肖艺 苏岚 高正勇
根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘宁宁 易萍 郭爱珍 胡长敏 陈颖钰
为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）的可视化LAMP检测法，利用LAMP引物设计软件，以溶血性曼氏杆菌保守基因lktC序列设计内引物、外引物及环引物，对其反应温度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度等条件进行优化，并检测了方法的敏感性、特异性及实用性。结果显示，该方法在68.2℃、6 mmol/L Mg~(2+)、1.6 mmol/L dNTPs条件下达到最佳，40 min内完成检测并可通过肉眼判定结果，对细菌的最低检测限为6.7×10~(-1) cfu/μL，对lktC重组质粒的最低检测限为7.9×10~2 copies/μL，敏感性高；与15种病原均不发生交叉反应，特异性好；对背景清晰小鼠肺组织样本检测结果显示该方法实用性良好，且优于普通PCR方法。表明该方法可快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
吴旭东 陆辰晨 沈浩 吴翠萍 张海峰 王源超 郑小波
[目的]应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的简便、快速和灵敏的大豆茎褐腐病菌[Phialophora gregata f.sp.sojae(PGS)]检测方法。[方法]利用LAMP技术,以ITS为靶序列,设计了4条特异性的LAMP引物和2条环引物,在此基础上建立了检测大豆茎褐腐病菌的LAMP体系。[结果]整个检测过程仅需1 h就可通过肉眼直接目测试验结果。在等温条件下(64℃)进行核酸扩增反应1 h,在扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,根据HNB的颜色变化可以判断PGS的存在与否。...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘星彤 林柏荣 廖金铃 卓侃
为了快速、简便、准确地检测重要植物病原线虫—最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus),依据GenBank中短体线虫的线粒体DNA细胞色素氧化酶I(mtDNA COI)序列,设计了扩增最短尾短体线虫的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并对LAMP反应条件进行优化,成功建立了一种可特异、快速检测最短尾短体线虫的LAMP体系。该体系在64℃下反应60min,扩增效率最高。用琼脂糖凝胶电泳、酶切分析和SYBR Green Ⅰ染色均能特异检测到最短尾短体线虫的扩增产物。所建立的LAMP体系能从供试的9种短体线虫和另外10种植物线虫中特异检测出最短尾短体线虫,其灵敏度可检测到1/200条线虫DNA,是常规PCR的10倍。表明本研究建立的最短尾短体线虫的LAMP检测体系,可用于最短尾短体线虫的快速检测。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
孙颖杰 岳志芹 刘荭 赵玉然 史秀杰 梁成珠 吴斌 李叶 王哲
建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
田擎 曾丹丹 李彬 张海峰 王源超 郑小波
［目的］黑白轮枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ－ａｔｒｕｍ）能够危害苜蓿等多种作物，是我国重要的检疫性病原真菌。我们基于环介导等温扩增技术（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｌａｍｐ），建立基于颜色判定的简单、快速和灵敏的黑白轮枝菌检测方法。［方法］基于ｌａｍｐ技术，通过比对分析黑白轮枝菌与其相似种不同靶标序列间的差异，选取ｔｕｂ（β－ｔｕｂｌｉｎ，编码β－微管蛋白）基因作为靶标基因，设计并筛选了４条特异性强、灵敏度高的ｌａｍｐ引物和１条环引物，在此基础上建立了检测黑白轮枝菌的ｌａｍｐ体系，并进行特异性、灵敏度试验及田间发病组织的检测。该方法．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
戴婷婷 陆辰晨 沈浩 王源超 郑小波
应用环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了基于颜色判定的简单、快速和灵敏的橡树疫霉菌(Phytophthora ramorum)检测方法。以ITS为靶序列对橡树疫霉菌的分子检测存在无法区分近似种的问题,笔者在橡树疫霉菌的基因组研究中,发现了PrA3aPro类转座子序列。生物信息学分析表明,该序列非常适合作为大豆疫霉分子检测的靶标。利用LAMP技术,以PrA3aPro为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立LAMP反应体系与条件,并进行灵敏度和特异性试验。结果表明:整个检测过程仅需1 h,即可通过肉眼直接目测试验结果。...
[期刊] 淡水渔业
[作者]
何亚鹏 陈怡静 时晓 张宝莉 温战华 陈春山 李博 杜迎春
实验建立了一套反转录环介导等温扩增方法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP),用于实验室及现场检测鲑鳟鱼传染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)。针对IHNV的核蛋白基因设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶及Bst DNA聚合酶的作用下进行反转录LAMP,结果阳性样本表现为荧光绿色,阴性样本仍为红棕色。反应条件优化结果表明最适反应温度为64℃;特异性试验表明仅IHNV发生特异性扩增,而SVCV、HRV、VHSV和H_2O均不发生反应;敏感性试验表明该LAMP方法可检出浓度为1.0×10~(-4)μg/μL的IHNV核酸。本研究所建立的IHNV反转录LAMP检测法成本低、操作简单、反应迅速、不依赖专门的仪器,同时具有较高的灵敏度和特异性,适合IHNV的现场检测和大批量样品的检疫。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张旭 王大菊 伍金娥
采用菌落计数法测定氟苯尼考对禽多杀性巴氏杆菌的体外抗菌药后效应(PAE)、抗菌后亚抑菌浓度效应(PA-SME)及亚抑菌浓度效应(SME)。结果显示:氟苯尼考在2~8 MIC(μg/mL)范围内对禽多杀性巴氏杆菌的PAE为1.31~5.01 h,PA-SME为1.66~24.20 h,SME为0.05~1.31 h;其PAE受药物浓度、细菌接触时间及接种量的影响。结果提示:临床应用氟苯尼考治疗禽多杀性巴氏杆菌病时,应结合药代动力学参数和MIC及PAE,制订给药方案。
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