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[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王资生 齐志涛 黄贝 张启焕 仇明 邵荣
根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
陈吉刚 杜海韬 熊娟 毛芝娟 杨季芳
采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%～48%和25%～92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,...
关键词：
鲈鱼 白细胞介素-8 克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘文强 赵宏坤
【目的】为了阐明重组蛋白的活性,置备具有生物学活性的重组白细胞介素18,应用于畜牧业生产。【方法】将含有山羊白细胞介素(gIL)-18基因的重组质粒pET-32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中以1mmol·L-1IPTG诱导4h或者更长时间进行表达。【结果】经SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆血清。经Western-blotting试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的...
关键词：
山羊 白细胞介素-18 表达 活性
[期刊] 中国水产科学
[作者]
邱丽华 冯娟 江世贵 张汉华 宋林生
采用同源克隆和锚定PCR技术,从军曹鱼(RachycentroncanadiumLinnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin 1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL 1β的cDNA全长1104bp,3′非编码区域(UTR)为255bp,5′UTR为108bp,开放阅读框(ORF)为741bp,编码246个氨基酸,分子量大约为27 68kD,理论等电点为5 71。同源性分析表明,该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL 1β基因具有很高的相似性,并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时,利用RT PCR技术,对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
王彦彬 卢中华 康相涛 宋素芳 孙桂荣 韩瑞丽 李国喜 李守义
参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PA...
关键词：
固始鸡 白细胞介素2 原核表达 生物活性
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘钦松 张丛丛 刘孟刚 许彤
构建人源白介素(h-IL2)基因的表达载体,并尝试在原核细胞中诱导表达,以用于进一步重组蛋白纯化和抗体生产。以h-IL2基因为模板,采用PCR技术扩增h-IL2基因,连接到pMD-18T载体中构建克隆载体,转化到感受态DH5α,提取质粒PCR、双酶切验证连接成功,经DNA测序鉴定基因序列与GenBank数据库收录h-IL2基因(NM_000586.3)序列一致;再将h-IL2基因插入到pGEX-4T-1构建表达载体,转化至感受态BL21(DE3),筛选阳性克隆IPTG诱导。SDS-PAGE验证成功表达融合蛋白GST-IL2。
关键词：
白细胞介素 基因克隆 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
李健 孟繁星 黎明 王日昕 石戈
实验从大弹涂鱼皮肤组织转录组中筛选出大弹涂鱼IL-8基因,并分析了其序列特征,构建了系统发生树,评估了IL-8基因在健康个体不同组织中的表达差异,以及在不同病原体刺激下IL-8基因在机体主要免疫器官肝脏和脾脏中的表达情况。结果显示,该基因的开放阅读框由306个碱基组成,编码101个氨基酸残基,包含典型的由18个氨基酸残基组成的信号肽,和1个由62个氨基酸残基组成的SCY结构域,该结构域还包含了4个保守的半胱氨酸残基,分别为Cys-30、Cys-32、Cys-57和Cys-73。大弹涂鱼IL-8氨基酸序列中的受体结合位点基序ELR (Glu-Leu-Arg)被Asn-Ser-His (NSH)取代,系统进化分析表明,纯化选择影响了鱼类该基序的多样性,且IL-8基因在大弹涂鱼乃至硬骨鱼中不可取代。荧光定量实验结果显示,IL-8基因在大弹涂鱼的健康组织中广泛表达,在鳃和脑中表达量最高。细菌和poly(I∶C)注射实验表明,在受到感染后,肝、脾和脑组织中IL-8的表达量均上调,说明IL-8基因在大弹涂鱼肝、脾和脑组织的炎性反应和免疫应答中起到了重要作用,为大弹涂鱼免疫基因的后续研究提供了参考。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫若潜 谢彩华 吴志明 张志凌 刘光辉 刘梅芬
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rCh...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
陈吉刚 陈维虎 周继勇 王金勇 齐静 郑肖娟 俞照正 孙红霞
将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/HisB,实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示,表达蛋白的分子量约为18kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体,建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA,探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2(0.4ng)对ConA活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性,而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性,而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马跃 王建珏 黄江涛 张天颖 史怀平
【目的】原核表达奶山羊表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白胞外区25-644位共620个氨基酸序列(ECD序列),纯化蛋白并免疫家兔,制备针对山羊EGFR蛋白的特异性多克隆抗体,为山羊EGFR蛋白功能研究奠定基础。【方法】以pMD19-T-EGFR为模板,采用PCR方法扩增得到EGFR胞外区(ECD)基因序列。将ECD序列连接pET-32a(+)质粒构建pET-32a(+)-ECD原核表达载体,将该重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导
[期刊] 水产学报
[作者]
李兰 高阿龙 陈建林 雷阳 吴丽婷 叶剑敏
为研究白细胞介素21（IL-21）及其受体IL-21R在鱼类抵御病原菌的免疫应答过程中的作用及在机体炎症中的分子机制，实验利用反转录PCR（RT-PCR）技术成功克隆了尼罗罗非鱼IL-21基因（OnIL-21）及其受体IL-21R基因（OnIL-21R），对其进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其mRNA水平的表达。结果显示，OnIL-21及其受体OnIL-21R的开放阅读框为420 bp和1 548 bp，分别编码139和515个氨基酸。经氨基酸序列预测分析，OnIL-21为分泌型蛋白，具有多个保守的磷酸化位点和一个Ig-like结构域；而OnIL-21R是跨膜蛋白，具有典型的γ-c链，氨基酸序列都具有多个保守的磷酸化位点和糖基化位点。系统进化树结果表明，IL-21与其受体IL-21R的氨基酸序列在物种进化过程中具有一定的保守性，尼罗罗非鱼IL-21和IL-21R的氨基酸序列均与斑马拟丽鱼IL-21和IL-21R的亲缘关系最近。组织差异性表达分析发现，OnIL-21及OnIL-21R在健康罗非鱼的多种组织中均有表达，但具有明显的组织差异性。OnIL-21在皮肤和心脏组织中表达量较高，在肌肉中较低；而OnIL-21R在鳃和脾脏组织中表达量最高，在肌肉中最低。无乳链球菌和嗜水气单胞菌体内感染和体外刺激白细胞后，头肾和脾脏中OnIL-21和OnIL-21R表达量均呈现显著上调，并在72 h内维持较高水平的表达，说明OnIL-21和OnIL-21R可能参与尼罗罗非鱼病原菌感染的免疫应答过程。此外，重组蛋白(r)OnIL-21刺激脾脏白细胞后，OnIL-21R和炎症相关因子基因（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10）的表达均发生显著上调，表明OnIL-21可调控其受体基因OnIL-21R的表达及参与调控机体的炎症反应。上述研究结果阐述了尼罗罗非鱼IL-21与其受体IL-21R的分子生物学特征，并初步阐明了二者参与了机体病原菌感染的免疫应答过程，为进一步探究IL-21通过其受体IL-21R调控机体免疫反应的作用机制和信号通路提供了重要参考。
[期刊] 水产学报
[作者]
李明云 苗亮 郭晓飞 聂力 侯红红 陈炯
为了解香鱼白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)的序列特征、系统发育及其与鳗利斯顿氏菌侵染的相关性,实验采用RACE-PCR方法扩增出香鱼IL-17C基因c DNA序列,并通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了鳗利斯顿氏菌侵染后香鱼各组织中IL-17C基因的表达变化。结果显示,香鱼IL-17C基因c DNA序列全长1 087 bp,含534 bp的开放阅读框,在3′端非编码区存在7个m RNA不稳定信号(ATTTA)。预测该基因编码177个氨基酸,N端19个氨基酸为信号肽
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
赵雅坤 史贤明 张忠明
人白细胞介素4(hIL4)是一种重要的免疫活性调节分子,与一些自身免疫性疾病有重要关系。将hIL4基因融合到衣藻叶绿体rbcL 5-’UTR和3’-UTR之间,组成5’UTR-hIL4-3’UTR片段,将其插入到来源于衣藻叶绿体基因组5.7 kb同源片段中,构建成pXhIL4同源重组质粒。利用电脉冲法将该质粒与含有aadA基因的壮观霉素抗性质粒p228共同转化衣藻叶绿体,从含100μg/mL的壮观霉素抗性平皿上筛选到阳性藻落,并通过PCR方法检测到hIL4基因,其共转化频率高达90%。经过western blotting印迹转移分析,证实了人白细胞介素4基因在衣藻叶绿体中获得成功表达,为进一步...
[期刊] 水产学报
[作者]
杨宁 周素明 王国良 刘顺 李猛
B型清道夫受体是清道夫受体超家族成员,可识别多种配体,在机体脂类转运及免疫防御过程中发挥重要作用。为深入研究三疣梭子蟹B型清道夫受体(Pt-SRB)的功能,本实验在前期工作基础上构建了Pt-SRB胞外结构域原核表达载体,并成功获得了重组蛋白rPt-SRB。利用亲和层析方法获得纯化的rPt-SRB,并将纯化rPt-SRB蛋白免疫大鼠获得抗rPt-SRB重组蛋白免疫抗血清以用于后续研究。SDS-PAGE检测发现,体外诱导表达重组rPt-SRB以包涵体的形式出现在大肠杆菌BL21裂解液的沉淀中,分子量大小约为4
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
冯宇倩 王璇 李东振 张伟 理永霞 张星耀
【目的】类毒素过敏原蛋白(VAPs)是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。【方法】本研究利用聚合酶链式反应(PCR)扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。【结果】松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP_1和Bx-VAP_2基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP_3和Bx-VAP_4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21～31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体antiVAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP_4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,BxVAP_1潜在的优势B细胞抗原表位较多。【结论】重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3效价高,特异性良好,Bx-VAP_1具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。
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