[目的]本文旨在对梨单糖转运蛋白(sugar transporter protein, STP)基因家族成员进行鉴定，分析其序列特性、基因结构、氨基酸序列保守功能域、染色体定位以及组织表达特性，为其功能研究奠定基础。[方法]基于梨的全基因组数据，采用生物信息学方法进行序列鉴定和分析。通过不同糖种类和浓度培养梨花粉来分析糖对花粉管生长的影响。利用转录组数据分析PbrSTP成员在花粉不同发育阶段的表达模式。通过亚细胞定位技术分析PbrSTP11在细胞中的分布情况，并利用反义寡聚脱氧核苷酸(as-ODN)技术和缺陷型酵母突变体验证PbrSTP11的功能。[结果]梨STP基因家族有35个成员，分为5个亚家族，各亚家族具有保守的基因结构和蛋白质基序。与无糖、葡萄糖和果糖培养基相比，含蔗糖的培养基对梨花粉的萌发和生长均具有显著的促进作用，而低浓度的单糖培养基也会促进梨花粉的萌发和生长，但其作用没有蔗糖显著。RT-qPCR结果表明，PbrSTP11基因在梨花粉中特异性表达。随着单糖浓度的升高，PbrSTP11基因的表达水平显著提高。亚细胞定位显示PbrSTP11蛋白定位在细胞膜上。酵母功能互补试验结果显示，PbrSTP11对葡萄糖、果糖具有转运能力，并且对葡萄糖的转运能力高于果糖，但PbrSTP11没有转运蔗糖和山梨醇的活性。利用as-ODN技术敲低PbrSTP11基因表达抑制了梨花粉管生长。[结论]PbrSTP基因家族成员高度保守；PbrSTP11定位于质膜，具有转运葡萄糖和果糖的能力，从而促进梨花粉管生长。

[目的]本文旨在鉴定分析CLE(CLAVATA3/Embryo surrounding region)多肽家族的特点及进化特征,深入了解蔷薇科果树CLE多肽的功能。[方法]基于全基因组测序结果,采用生物信息学方法,参考拟南芥中CLE多肽序列鉴定梨、苹果、桃、梅、草莓和黑树莓6个蔷薇科果树物种CLE多肽家族序列信息,重点分析梨CLE多肽家族的基因结构和理化特性等;通过转录组数据分析PbrCLE成员在不同组织以及在花柱和花粉不同发育阶段的表达模式;并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析5个PbrCLE成员在花粉和花柱中的表达模式。通过外源CLE多肽处理梨花粉,研究其调控花粉管生长的功能。[结果]本研究在蔷薇科果树中共筛选到91个CLE候选基因。各物种CLE基因不均匀分布在5～12条染色体上。聚类分析将所有CLE基因分为4组。K_a/K_s分析表明大部分PbrCLE基因都经历了纯化选择。转录组结果表明大部分CLE基因在梨不同组织中的表达量均较低,这与多肽信号分子在植物体内含量较低相一致。外源合成的PbrCLE31多肽可以抑制体外培养的梨花粉管生长。[结论]蔷薇科果树中存在保守的CLE基因,并且PbrCLE31多肽可以抑制梨花粉管的生长。

用荧光显微镜对自交不亲和强度不同的梨品种丰水和菊水自花授粉及以丰水为母本的异花授粉后的花粉萌发及花粉管生长特性进行观察。结果表明 ,自花与异花花粉在柱头上均有较高的萌发率 ,高达 95 %以上 ,且二者间没有显著的差异。自花与异花花粉管在花柱内的生长速度及停止生长的位置不同 ,丰水自花花粉管生长到花柱 1/ 3处就完全停止生长 ,表现为强自交不亲和性 ,而菊水自花花粉管大部分也在花柱 1/ 3处停止生长 ,但仍有少量长至花柱基部 ,表现为弱自交不亲和性 ;而异花授粉的花粉管虽然在花柱内也有停止生长现象 ,但大量的花粉管能长到花柱基部 ,表现为杂交亲和性。花柱内自花授粉的花粉管在停止生长之前有弯...

[目的]本文旨在对前酪氨酸脱水酶(ADT)基因家族进行鉴定,分析其进化过程、基因结构、保守功能域、共线性关系和表达特性,并对梨ADT在石细胞形成过程中的功能进行初步验证。[方法]基于已公布的20个物种全基因组数据,采用BLASTp和Hmmer结合的方法进行成员鉴定,通过多种生物信息学手段分析序列。利用转录组数据和RT-qPCR检测梨ADT成员在果实发育中各个阶段的表达模式。利用农杆菌介导的瞬时转化法在梨幼果中过量表达PbADT1基因,通过间苯三酚染色观察幼果石细胞团分布,并测定木质素含量及其通路基因的表达量。[结果]在20个物种中共鉴定了113个ADT家族成员。通过系统进化树将家族成员分为4个亚组,6个水生藻类中都仅有1个ADT基因被鉴定,随后进化出的陆生植物中ADT基因家族均得到了不同程度的扩张。梨果实发育的转录组数据表明,多个ADT基因的高水平表达集中在花后35 d, RT-qPCR的结果证实了这一点。PbADT1的瞬时过量表达使梨幼果石细胞和木质素含量增加,并提高了木质素关键合成酶的表达水平。[结论]ADT基因在植物从水生向陆生进化的过程中得到了大量扩张,其蛋白水解酶生成的苯丙氨酸是合成木质素和形成维管束的底物基础。梨石细胞在幼果发育期大量形成,ADT在梨中的表达模式表明该基因家族可能调控果实石细胞的形成,PbADT1在梨果实中的瞬时过量表达使木质素含量升高、石细胞扩散加剧,表明ADT基因的过表达可能通过提高关键合成酶的表达水平对梨石细胞的形成产生影响。

[目的]本文旨在对梨的类防御素(DEFL)基因家族成员进行鉴定,分析其序列特性、进化关系、基因结构、氨基酸序列保守功能域、染色体定位和在梨中的表达特性,为PbrDEFL功能研究和应用奠定基础。[方法]基于梨的全基因组数据,采用生物信息学方法进行序列鉴定和分析;通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和转录组数据分析PbrDEFL成员在各组织中和花粉管发育阶段的表达模式。利用亚细胞定位技术分析PbrDEFL38与PbrDEFL15在细胞中的分布情况,并且进一步分析PbrDEFL38与PbrDEFL15重组蛋白在大肠杆菌原核表达纯化过程中所需的最佳条件。[结果]梨中包含39个PbrDEFL基因(PbrDEFL1—PbrDEFL39),可分为2个组,均存在稳定的半胱氨酸αβ模型(CSαβmotif),且在9条染色体上呈不均匀分布,在进化过程中主要受纯化选择作用。RT-qPCR结果表明,PbrDEFL在各组织中表达且具有特异性,主要集中在花粉或叶片中;此外,在‘砀山酥梨’和‘黄花’2个梨品种花粉发育过程中,超过60%的PbrDEFL基因表达量均呈先升高后下降的趋势。PbrDEFL蛋白亚细胞定位预测均位于胞外,并通过PbrDEFL38-GFP和PbrDEFL15-GFP在烟草细胞中表达得到证实。通过不同浓度IPTG筛选,最终确定在15℃和IPTG终浓度为0.5 mmol·L~(-1)时,PbrDEFL38和PbrDEFL15蛋白表达量最高。[结论]PbrDEFL基因家族成员高度保守,主要在胞外起重要作用,其不仅在植物免疫防御过程中发挥重要作用,还可能参与了梨花粉管生长发育和自交不亲和过程。

【目的】明确梨ARF转录因子在梨基因组中的数量、结构和组织表达差异,为揭示ARF转录因子在梨树生长素信号途径及在矮生梨生长发育中的作用奠定理论基础。【方法】根据文献报道的苹果、拟南芥等植物中的ARF转录因子基因,利用BLAST软件鉴定梨基因组中的ARF。采用SMART、PROSITE、Web Logo 3、DNAMAN 5.0、MEME、GSDS 2.0和MEGA 5.1等软件对其蛋白和基因序列进行生物信息学分析。采用q PCR方法检测梨ARF在矮生梨‘中矮1号’不同组织器官及3个不同生长势梨品种木质部和

【目的】鉴定桑树中MaCWIN （Cell wall invertase， CWIN）和MaCIF （Cell wall invertase inhibitor， CIF）家族基因，为揭示桑树MaCWIN与MaCIF家族基因的功能及筛选优质种质资源奠定基础。【方法】以拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）和杨树（Populus trichocarpa L.）的CWIN和CIF家族基因为参考，在MorusDB数据库中筛选桑树的MaCWIN和MaCIF家族基因，用PCR基因克隆技术对其进行克隆，并进行motif分析、多序列比对分析、系统发生分析、蛋白特征分析、亚细胞定位预测，通过RT-qPCR技术分析MaCWIN和MaCIF家族基因在不同组织和果实不同发育时期的表达谱，分析MaCWIN和MaCIF之间的相关性，通过病毒诱导的基因沉默技术在桑树体内敲低MaCWIN和MaCIF家族基因的表达量并观察表型。【结果】筛选出MaCWIN和MaCIF家族基因各5个，成功克隆出4个MaCWIN基因和3个MaCIF基因，MaCWIN家族基因CDS区域长度为1722～1989 bp；MaCIF家族基因CDS区域长度为537～582 bp；MaCWIN1、MaCWIN2、MaCWIN4、MaCWIN5为酸性转化酶，MaCIF1、MaCIF3和MaCIF4为酸性转化酶抑制子；MaCWIN1、MaCWIN2和MaCWIN4属于细胞壁转化酶，MaCWIN5是液泡转化酶。MaCWIN1在幼叶表达量最高，MaCWIN2表达量随果实成熟逐渐积累，其他基因均表现出组织特异性；病毒诱导的基因沉默试验结果显示，MaCWIN1和MaCIF1基因的敲低导致相应植株发育延迟。【结论】MaCWIN和MaCIF基因家族是桑树体内重要的功能基因，首次克隆了MaCWIN和MaCIF基因编码区，确定其分类，其中MaCWIN1和MaCIF1是影响桑树生长发育的关键基因。为了解MaCWIN和MaCIF家族基因在桑树中的功能及培育桑树新品种提供理论基础。

【目的】对梨Puc ACO、Puc ACS基因家族进行生物信息学分析,为进一步研究Puc ACO、Puc ACS基因家族在梨生长发育过程中的功能奠定基础。【方法】在‘中矮1号’基因组中鉴定出梨Puc ACO、Puc ACS基因家族,利用Ex PASy、Plant-m PLo、Net Phos等软件分析Puc ACO、Puc ACS蛋白的理化性质,使用TBtools分析Puc ACO、Puc ACS基因家族的基因结构、构建进化树及共线性分析,使用Swiss-Model、I-TASSER、ROBETTA预测Puc ACS、Puc ACO蛋白的3D模型,并使用SAVEs6.0对其进行质量评估,再使用VMD对Puc ACO、Puc ACS蛋白的三级结构进行美化。【结果】共鉴定出8个梨Puc ACO基因和8个梨Puc ACS基因,其中梨Puc ACO基因编码蛋白长度为226～322个氨基酸,核苷酸序列一致性及氨基酸序列同源性分别为38.05%～99.78%和29.39%～99.70%,相对分子质量为25.75～36.54 ku,等电点为5.07～5.84;所有Puc ACO基因编码的蛋白质均为亲水性蛋白质,部分为不稳定蛋白,亚细胞均位于细胞质中,脂肪系数为76.13～89.25,热稳定性比较好。梨Puc ACS基因编码的蛋白长度为432～794个氨基酸,核苷酸序列一致性及氨基酸序列同源性分别为31.79%～100%和30.00%～100%,相对分子质量为48.41～89.77 ku,等电点为5.48～8.41;不稳定系数均大于40,为不稳定蛋白质;Puc ACS2位于细胞质中,其余均位于叶绿体中;脂肪系数为77.17～84.40,热稳定性较好,均为亲水性蛋白质。Puc ACS和Puc ACO蛋白生物学功能主要以丝氨酸磷酸化修饰为主,均不含信号肽位点,无跨膜结构,且不含GPI锚定蛋白位点。二级结构预测结果表明,Puc ACS、Puc ACO蛋白质结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主,Puc ACS中包含多个保守的脯氨酸,Puc ACO中包含多个保守的组氨酸。梨Puc ACS基因家族分为3类,Puc ACO基因家族可以分为2类,Puc ACS、Puc ACO家族各成员的基因结构和保守基序差异较小,内含子数量和所包含的基序大致相同。梨Puc ACS、Puc ACO基因家族启动子顺式作用元件分析结果表明,该启动子中存在多种与植物生长调控、植物激素调节、逆境诱导等相关的作用元件。拟南芥与梨共存在24对共线性关系,其中Puc ACS家族与拟南芥构建了16对共线性关系,Puc ACO家族与拟南芥构建了8对共线性关系。梨物种内部的共线性分析结果表明,Puc ACO家族之间存在3对共线性关系,Puc ACS家族之间存在4对共线性关系。【结论】鉴定出8个梨Puc ACS基因和8个梨Puc ACO基因,其生物信息学分析结果丰富了梨Puc ACS和Puc ACO基因的分子生物学理论。

脱落酸(ABA)是一种内源性激素,在调节植物的生长发育、非生物胁迫和生物胁迫反应方面发挥着重要作用。Pyrabactin resistance 1-like(PYR/PYL)蛋白在ABA信号传导途径中起核心调控作用。然而,在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)中并没有关于这个家族的细节。本研究根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的14个PYL基因,利用BLAST方法鉴定蒺藜苜蓿基因组中的PYL家族成员。结果表明,鉴定得到14个蒺藜苜蓿PYL基因家族成员,且所有成员均含有PYR-PYL-RCAR-like功能域。预测启动子中的顺式元件发现所有蒺藜苜蓿PYL基因家族成员均含有与胁迫以及激素相关的元件。基因本体论(GO)富集分析与KEGG通路分析显示其主要参与到脱落酸信号通路及对外界刺激的反应。基因表达模式分析显示,其在逆境胁迫下表现出特定的表达模式。本研究为进一步研究蒺藜苜蓿PYL基因奠定了基础。

【目的】最近在植物中发现了一类Ca2+传感蛋白——类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL(calcineurin B-likeproteins),CBL及其靶蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)构成CBL/CIPK信号网络系统,在植物干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答中起重要作用。鉴定梨基因组中CBL家族基因成员,对其基因进化、结构与表达特征进行分析,为植物CBL基因功能分析与利用提供依据。【方法】通过生物信息学手段,结合梨基因组注释信息,鉴定梨CBL家族成员序列信息;利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树;利用per1程序、GSDS工具以及Clu...

为了探究圆齿野鸦椿Hsp20基因在强光、高温胁迫中的作用，利用生物信息学的方法对圆齿野鸦椿Hsp20基因家族进行全基因组鉴定，并从理化性质、系统进化、保守基序及基因结构、染色体定位及物种间共线性、顺式作用元件预测、蛋白网络互作和表达模式等方面进行分析.结果表明：圆齿野鸦椿含有32个Hsp20基因，分布在9条染色体中，分为5个大家族和12个亚家族，多数基因有1个内含子.EkHsp20家族的主要扩增方式为片段复制.圆齿野鸦椿含有多个非生物胁迫响应元件和激素类响应元件，如光响应元件、脱落酸响应元件等.表达量分析结果表明，圆齿野鸦椿Hsp20基因与Hsp101基因有蛋白网络互作关系.ER家族是一类提高植株的抗冷性的基因，圆齿野鸦椿基因组中缺失ER基因家族，这可能与其不耐寒相关.根据高温、持续强光导致叶片蜷缩的现象，结合EkHsp20-04、EkHsp20-20、EkHsp20-25在系统发育树中与拟南芥Hsp17.6b聚合在一起、与拟南芥Hsp101呈现蛋白互作关系，且均为CⅠ家族成员，推测EkHsp20-20、EkHsp20-04、EkHsp20-25可能是促使圆齿野鸦椿在高温条件下产生自我防御行为的主要基因.

【目的】分析番杏[Tetragonia tetragonoides (Pall.) Kuntze]中TtLIM基因家族的序列组成、RNA-seq基因表达和异源表达生物学功能，探究其可能参与调控番杏植株发育和胁迫应答反应的分子机理，为发掘番杏抗逆功能基因及其在作物育种中的应用提供理论基础。【方法】通过前期对番杏(Tetragonia tetragonoides (Pall.) Kuntze)cDNA文库的筛选，获得一个编码番杏LIM基因的全长cDNA，命名为TtWLIM1b。对TtWLIM1b在酵母中进行了功能分析。结合番杏全基因组测序信息，从番杏基因组中鉴定出16个TtLIM基因，对这些家族成员的染色体定位、所编码蛋白的理化性质、系统进化以及蛋白的保守模式进行综合的生物信息学分析；构建了番杏与拟南芥、水稻和紫花苜蓿的LIM蛋白家族成员的进化树。最后，通过RNA-seq分析TtLIM基因家族成员在番杏不同组织以及在不同胁迫处理后的相对表达量。【结果】异源表达TtWLIM1b能够提高转基因酵母的重金属耐受性及耐热的能力；番杏TtLIM家族蛋白成员均含有LIM结构域，而该结构域富含半胱氨酸。因此，TtLIMs也是富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich protein， CRP)的一种。序列分析表明，番杏LIM蛋白成员具有高度的保守性，且其成员的复制扩增较为明显；TtLIM基因家族成员在不同的番杏器官中广泛而有差异地表达。【结论】番杏TtLIMs可能参与调控番杏植株发育和胁迫应答反应。

[目的]Shaker基因家族在植物应对低钾环境胁迫和盐胁迫过程中发挥重要作用。杜梨是我国梨生产中应用较广的砧木,鉴定梨Shaker基因家族并研究其在杜梨低钾和盐胁迫下的响应,为提高杜梨耐低钾和盐胁迫提供理论依据。[方法]结合已公布的梨全基因组及拟南芥基因组相关数据,鉴定梨Shaker基因家族成员并分析其进化特征,通过RT-qPCR技术分析在低钾和盐胁迫下基因在杜梨幼苗根部表达特征。[结果]在全基因组中鉴定出9个梨Shaker家族的候选基因,这些基因分布在梨7条染色体上,根据进化分析将其分为5个亚族(Ⅰ—Ⅴ)。家族成员氨基酸序列大小、相对分子质量和等电点分别为587～1 481、(67.91～168.80)×10~3和6.23～8.80,亚细胞定位预测显示该家族成员主要定位于细胞质膜。基因结构分析发现,各亚族具有相似的外显子/内含子结构,但外显子和内含子数量不同。启动子顺式作用元件分析结果表明,PbShaker的启动子含有与抗氧化剂、低温、激素、干旱胁迫等相关的顺式作用元件。杜梨幼苗根中PbAKT1.1、PbAKT2/3和PbKC1.2在低钾胁迫15 d的表达量均明显上调,而盐胁迫下所有基因表达量均明显上调。PbAKT1.1/1.2和PbKC1.1在轻度盐胁迫下表达量高于重度盐胁迫的表达量,表明重度盐胁迫抑制其转录丰度;PbKC1.2随盐胁迫程度增加其表达量增加。[结论]梨Shaker基因家族成员在低钾和盐胁迫下有不同程度的响应,表明其在耐低钾和耐盐方面可能有不同的作用机制。

【背景】花青素是紫色不结球白菜中重要的营养成分之一，谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase,GST）在花青素转运中发挥着重要功能。【目的】鉴定不结球白菜中编码GST的基因，并通过转录组和分子生物学手段揭示BcGSTF6在不结球白菜花青素转运中的作用，解析不结球白菜花青素积累的分子机制。【方法】通过生物信息学方法，鉴定GST基因家族成员并分析其在染色体上的位置和基序；在紫色和绿色的不结球白菜中进行转录组分析，筛选不结球白菜中参与花青素转运的基因，并通过表达模式分析、亚细胞定位、拟南芥突变体tt19的异源回补试验进一步验证BcGSTF6和BcTT19的功能；通过将BcGSTF6和BcTT19与其他物种中参与花青素转运基因的氨基酸序列进行比较，分析BcGSTF6存在的差异；并通过BcGSTF6蛋白与矢车菊素（Cya）的体外结合和基因沉默试验验证BcGSTF6是否为参与不结球白菜花青素转运和积累的重要基因。【结果】从不结球白菜中鉴定得到83个GST基因家族成员，分为8个亚家族，分布在10条染色体上。转录组分析结果表明BcGSTF6和BcTT19可能是参与不结球白菜花青素转运的基因，进一步利用qRT-PCR发现BcGSTF6与BcTT19都在不结球白菜花青素积累阶段高度表达；亚细胞定位结果表明BcGSTF6和BcTT19都定位于内质网和液泡膜中。氨基酸序列多重比较发现BcTT19与其他物种中参与花青素转运的蛋白存在高度同源性，而BcGSTF6则在保守结构域中存在较大差异。在拟南芥突变体tt19中对BcGSTF6和BcTT19进行过表达均可恢复拟南芥幼苗tt19积累花青素的表型，但不能恢复其种皮棕色的表型，表明BcGSTF6和BcTT19都参与了花青素的转运但不能转运原花青素（PAs）。体外结合试验发现BcGSTF6蛋白在室温下可增加Cya的可溶性；对BcGSTF6在不结球白菜中进行基因沉默发现叶片中花青素含量显著下降，同时也导致参与花青素合成与调控相关基因表达量降低。证明BcGSTF6参与了花青素的转运和积累，在不结球白菜叶片着色过程中发挥重要功能。【结论】本研究鉴定了不结球白菜GST基因家族，并进一步解析了BcTT19和BcGSTF6在不结球白菜花青素转运和积累中的功能，阐明了BcGSTs在不结球白菜中花青素转运调控的部分机制。