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[期刊] 华北农学报
[作者]
张杰 杨炜茹 郝瑞杰 张启翔
CBF转录因子在植物冷驯化中起着重要调控作用。以欧洲甜樱桃CBF基因为信息探针,从李属基因组数据库中得到一个候选序列,设计特异引物,通过PCR扩增和RT-PCR验证,发现与预测序列一致。该基因全长711bp,可编码225个氨基酸,序列分析发现其具有CBF基因的特征序列,包含保守的AP2/EREB DNA结合域以及CBF特征短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR。同源性分析显示,PmCBF和欧洲甜樱桃、矮扁桃CBF基因一致性较高,均在90%以上,与欧洲甜樱桃的氨基酸同源性达100%。实时荧光定量PCR分析发现:4℃低温胁迫下,PmCBF在转录水平的表达情况和其他植物CBF基因...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭婷 王艺琴 陈曼曼 冯蓝萍 包满珠 张俊卫
为揭示梅花WRKY基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’(Prunus mume ‘Xuemei’)中分离得到1个WRKY转录因子基因PmWRKY40。序列分析结果显示,该基因cDNA全长1 072bp,完整开放阅读框972bp,编码323个氨基酸,包含1个WRKY结构和1个C2H2型锌指结构。系统进化分析结果显示,梅花PmWRKY40蛋白与欧洲甜樱桃亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明:PmWRKY40基因受低温、氧化胁迫诱导,但诱导程度存在差异。此外,SA处理显著提高PmWRKY40的表达,ABA处理则抑制该基因表达。推测PmWRKY40可能在梅花响应低温胁迫过程中起重要作用。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李玉舒 杨炜茹 程堂仁 王佳 张启翔
ＳＯＣ１／ＴＭ３（ＳｕｐｐｒｅＳＳＯｒ Ｏｆ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅＳＳｉＯｎ Ｏｆ ＣＯｎＳＴａｎＳ １／ＴＯＭａＴＯ ＭａＤＳ－ｂＯｘ ｇｅｎｅ ３）是ＭａＤＳ－ｂＯｘ家族一员，它能够整合多条开花途径的开花信号，调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花成花转变过程的分子机理，采用ｒＴ－ｐＣｒ的方法从梅花长蕊绿萼中克隆到３个ＳＯＣ１的同源基因，分别命名为ｐＭ ＳＯＣ１－１、ｐＭ ＳＯＣ１－２和ｐＭＳＯＣ１－３，并采用荧光定量ｐＣｒ对３个基因的表达模式进行了分析。序列分析表明，３个基因的编码区长度分别为６４５ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－１）、６５４ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－２）和６６０ ｂｐ（ｐＭ．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
彭婷 冯蓝萍 王艺琴 任静 包满珠 张俊卫
为阐明梅花(Prunus mume)ERF基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’中克隆获得1个PmERF4基因。生物信息学分析表明该基因cDNA全长序列为842 bp,完整开放阅读框(ORF)为690 bp,编码229个氨基酸。氨基酸序列比对发现,PmERF4蛋白包含1个AP2/ERF保守结构域。系统进化分析结果显示,梅花PmERF4蛋白与李亚科李属植物的ERF蛋白高度同源。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PmERF4基因在非生物胁迫和激素处理下的表达,结果表明:PmERF4基因受低温、氧化胁迫的诱导,但响应程度不同,它能够持续且强烈地响应低温胁迫,对甘露醇、MeJA、SA处理不敏感,而高盐和ABA则抑制其表达;PmERF4基因可能在梅花低温胁迫应答中发挥重要作用。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 张伟 赵海平 王大涛 李春义
为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
郭梦雅 韩若冰 邢海华 张芙蕊 李和平
为分析梅花鹿KGF基因的生物学特性及其在鹿茸生长不同阶段顶端茸皮组织的表达差异，以雄性梅花鹿茸皮组织为试验材料克隆梅花鹿KGF基因，并采用荧光定量PCR技术对KGF基因在梅花鹿鹿茸顶端不同生长阶段的茸皮组织中的表达量进行差异分析。结果表明：1）成功克隆获得梅花鹿KGF基因的完整编码区，全长为585bp，共编码194个氨基酸；KGF基因编码的蛋白质是具有跨膜结构的不稳定的亲水蛋白，其相对分子质量为22 489.17，理论等电点pI为9.35；二级结构以无规则卷曲为主；2）通过Blastp功能比对显示梅花鹿KGF基因与马鹿、白尾鹿、牛、野牛、山羊的相似性均在99%以上；3）荧光定量PCR结果显示，KGF基因的表达量在梅花鹿鹿茸前期与中期、前期与后期的顶端茸皮组织中差异显著（P0.05）。综上，本研究发现梅花鹿KGF基因在进化中的保守性较高，对鹿茸的生长发育与组织修复有重要作用，其在不同时期茸皮组织中的相对表达量存在差异。本研究为进一步探索鹿茸生长的分子机理奠定基础，为哺乳动物的组织创伤修复提供参考。
关键词：
梅花鹿 KGF基因 基因表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙海龙 宋娟 高志红 倪照君 章镇
【目的】从‘大嵌蒂’果梅中克隆PmKNAT2,并对其结构特征及表达模式进行分析,为研究果梅雌蕊败育的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中查找与果梅相似性很高的桃KNOPE2(KNAT2的同源基因)序列(EF093491),根据桃的KNOPE2序列设计特异引物;采用改良CTAB法提取‘大嵌蒂’果梅花芽总RNA;通过RT-PCR和RACE技术获得基因cDNA序列全长;使用DNAMAN软件进行序列拼接;利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;通过生物信息学方法分析结构特征;用DNAMAN软件分析基因的ORF和氨基酸序列;MEGA4.0软件进行系统进化树的构建;...
[期刊] 林业科学
[作者]
谢树章 秦平伟 张迷 胡雨晴 李名扬 眭顺照
在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130)。CpchiacDNA全长为1184bp,开放阅读框为954bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为ClassⅠb型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL2l细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200U.mL-1。酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH7.0有...
关键词：
几丁质酶 克隆 原核表达 蜡梅
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
过聪 张佳琪 张俊卫 包满珠
为了找到梅花抗寒关键基因,进一步了解梅花的抗寒分子机理,在分析了NCBI核苷酸数据库中已公布的CBF/DREB1同源基因序列基础上,通过基因同源克隆结合RACE技术,在‘雪梅’花蕾cDNA文库以及‘雪梅’gDNA中均成功扩增得到梅花的1个CBF/DREB1类基因,命名为PmCBFa。该基因CDS区全长845bp,编码231个氨基酸。经核苷酸序列分析、预测编码氨基酸序列比对分析以及编码蛋白系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白具有CBF/DREB1类转录因子保守的AP2结构域及其两翼结构序列,且与桃的DREB1同源蛋白同源性最高。该研究结果为后续PmCBFa基因在梅花抗寒分子机理的研究中提供了理论...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李晨宇 足木热木·吐尔逊 李晓荣 杨洋 李波 于月华
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用，而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值，因此，从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列，并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，通过Gataway BP和LR反应，将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件，最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示，GhMYB42(XP＿016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸，预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现，MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域，是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示，陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP＿012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显，因此，选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明，重组蛋白的大小正确，最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白，后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。
[期刊] 水产学报
[作者]
雷丽娜 高谦 王伟 孙兆盛 罗璋 刘其根
为进一步了解花鲈适应性免疫机制在病害防治中的作用，本研究通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了免疫球蛋白M重链（IgMH）和主要组织兼容性复合体（Major histocompatibility complex class II，MHCII）β基因的全长；通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测它们在花鲈各组织中组织分布情况以及LPS、Poly (I:C) 刺激及迟缓爱德华氏菌人工感染后mRNA水平的表达变化情况；构建了IgMH-pET21d、IgMCH_(1-2)-pET21d和MHCⅡ β-pET21d原核重组表达质粒，进行重组蛋白表达，并通过分子筛层析技术纯化花鲈IgMH、IgMCH_(1-2)和MHCⅡ β重组蛋白，进而制备了抗花鲈IgM的多克隆抗体。结果表明，花鲈IgMH和MHCII β的cDNA全长分别为1 977 bp和1 242 bp；它们在鳃、脾脏和头肾等免疫相关组织中mRNA水平的表达量较高；LPS、Poly (I:C) 刺激及迟缓爱德华氏菌人工感染花鲈导致鳃、脾脏和头肾中这两个基因的表达水平发生显著变化，表明IgMH和MHCII β均参与了花鲈的抗感染免疫反应；此外，抗花鲈IgM的多克隆抗体能与花鲈全血清发生强烈反应，与鳜全血清弱反应，与大口黑鲈和草鱼的不发生反应，推测其反应强度反映了物种间亲缘关系的远近。本研究首次克隆了花鲈的IgMH和MHCⅡ β基因全长，表达了IgMH和MHCⅡ β原核重组蛋白，制备了抗花鲈IgM的多克隆抗体，揭示了IgMH和MHCⅡ β基因参与花鲈的抗感染免疫应答，为深入研究花鲈的免疫调控机制和疾病防控策略奠定了基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
吕素慧 郗琳 聂静 温超 袁存权 马男 赵梁军
以切花菊‘神马’（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ‘Ｊｉｎｂａ’）为材料，利用ｒａＣｅ技术与同源克隆方法获得菊花ＣｍＰｉｎ１基因全长，通过ｑｒｔ－ＰＣｒ技术比较ＣｍＰｉｎ１在不同组织器官的表达，同时对ＣｍＰｉｎ１响应外施ｎａａ和去顶进行研究。结果表明：１）ＣｍＰｉｎ１基因ｏｒｆ全长１ ７６１ｂＰ，编码５８６个氨基酸，跨膜域位于蛋白ｎ端与Ｃ端；通过蛋白序列比对分析，菊花ＣｍＰｉｎ１蛋白与百日草ＺｖＰｉｎ１蛋白相似性最高；亚细胞定位结果显示ＣｍＰｉｎ１位于细胞膜；２）对ＣｍＰｉｎ１表达分析表明，该基因在菊花茎部与芽部具有相对较高的表达量，同时，在离体茎段中的ＣｍＰｉｎ１受到生长素诱．．．
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
洪方蕾 陆瑶 俞世姣 胡芷诺 缪云锋 钟诗蔚 赵宏波
【目的】研究OfABF基因家族成员在桂花‘堰虹桂’Osmanthus fragrans ‘Yanhonggui’不同组织和花开放进程中的表达模式，筛选参与调控花开放的关键成员。【方法】在桂花基因组数据库中筛选出相关OfABFs基因序列，克隆序列全长并对其进行生物信息学分析，通过荧光定量PCR分析OfABFs基因在‘堰虹桂’不同组织及花开放进程中的时空表达模式。【结果】筛选得到5条OfABFs基因序列。生物信息学分析得出：桂花OfABFs蛋白具有亲水性，较不稳定，无信号肽段；预测其蛋白二、三级结构具有相似的特性，无规则卷曲和α-螺旋为其结构组成的主要元件；5条OfABFs转录因子均含有bZIP转录因子家族保守结构域。亚细胞定位预测表明：5条OfABFs编码蛋白均定位在细胞核。荧光定量PCR结果表明：OfABF1、OfABF2、OfABF3、OfABF4和OfABF6在桂花中的表达具有组织特异性，其中OfABF1、OfABF4和OfABF6在花中有较高表达。OfABF1在顶壳期被转录激活，表达显著升高；铃梗期后表达水平虽呈下降趋势，但仍保持较高水平。OfABF2的表达在顶壳期到达峰值，且相对表达水平明显高于其他时期。OfABF3、OfABF4和OfABF6在花朵衰老期的相对表达量最高。【结论】OfABF1、OfABF2可能与桂花花开放进程有关，而OfABF3、OfABF4和OfABF6参与调控桂花花朵衰老的可能性较大。图10表4参32
关键词：
桂花 ABF转录因子 表达分析 花开放
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
蒋琦妮 付建新 张超 董彬 赵宏波
AP1(APETALA1)基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’ Osmanthus fragrans ‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即Of AP1基因,其中开放阅读框长为720 bp(注册号为MH593222)。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%～88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的Of AP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中, Of AP1在成花转变及花芽分化初期(花瓣、花萼分化期)表达量较高,随后呈下降趋势。这说明Of AP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王威姣 李菲 张皖皖 王银杰 宋爱萍 蒋甲福 陈发棣 陈素梅
[目的]本文旨在克隆菊花β-石竹烯合成酶同源基因(CmTPS1like)并探讨其参与蚜虫取食和茉莉酸甲酯(MeJA)处理应答表达的机制。[方法]以菊花‘神马’为试验材料,采用高保真PCR及染色体位移法分别克隆CmTPS1like基因全长及上游启动子序列,并采用RT-qPCR分析CmTPS1like基因的组织特异性表达以及响应蚜虫取食和MeJA处理的表达模式。[结果]CmTPS1like基因开放阅读框(ORF)共有1 644个碱基,编码548个氨基酸,且与菊科植物野菊同源性最高(95.26%)。CmTPS1like基因上游启动子区包括2个MeJA响应元件、5个MYC结合元件、2个MYB结合元件、5个光响应元件等。CmTPS1like基因在茎中表达量最高,叶和根中表达量次之,花中表达量最低。蚜虫取食12和24 h后,菊花叶片中CmTPS1like基因的表达水平上调。随着MeJA处理时间的增加(3～24 h),CmTPS1like基因被持续诱导表达。[结论]CmTPS1like基因在菊花‘神马’茎中表达量最高,其表达受蚜虫取食和MeJA处理的影响。
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