[目的]分离和鉴定梅花鹿鹿角盘活性肽,并研究其抑菌活性,为其制备和开发利用提供参考。[方法]利用酸提醇沉法从梅花鹿鹿角盘粉末中提取总蛋白,过0.45μm滤器后,用凝胶过滤层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法,从鹿角盘总蛋白中分离、纯化天然活性肽,利用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法对其进行鉴定,通过二倍稀释法分析天然活性肽对大肠杆菌(Esch erich ia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌浓度(minimal inhibit concentration,MIC);在此基础上,以不添加活性肽的菌悬液为对照,用不同质量浓度的天然活性肽处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,检测菌液的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性和电导率,分析天然活性肽对病原菌菌体生长曲线以及细胞壁和细胞膜的影响。[结果]从梅花鹿鹿角盘总蛋白中成功分离出纯度为93.70%的天然活性肽,其相对分子质量为4 543.14,序列与抗菌肽(UNIPORT:A8QJ91)相似,并将其命名为梅花鹿鹿角盘活性肽(sika antler plate bioactive peptide,SAPBP)。SAPBP对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为0.5和1 mg/mL,对以上2种病原菌的生长曲线有明显影响。与对照相比,不同质量浓度SAPBP作用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体后,碱性磷酸酶活性和菌液电导率均明显上升,可知SAPBP对病原菌菌体细胞壁和细胞膜造成不同程度的损伤,其中2 MIC SAPBP对病原菌的破坏作用最为明显。[结论]从梅花鹿鹿角盘总蛋白中分离纯化出了天然活性肽,该活性肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。

利用活性炭的吸附作用,对梅花鹿胎盘寡肽脱色脱腥的最佳工艺进行研究。通过正交试验方差分析研究脱色脱腥过程中的最佳工艺条件。各试验因素对脱色率的影响顺序为:添加量>脱色温度>脱色时间;对于寡肽损失率的影响顺序为:添加量>脱色时间>脱色温度。结果表明:利用活性炭对梅花鹿胎盘寡肽脱色脱腥的最佳工艺条件为:活性炭用量2.0%,脱色pH值11,脱色温度70℃,脱色时间60min。此工艺条件下脱色率为74.8%,寡肽损失率为19.5%,无腥味。

为研究梅花鹿Thymosin beta 10基因(Tβ10)在鹿茸快速生长过程中的作用,利用Gateway技术构建梅花鹿Tβ10基因的原核表达载体—pDEST17-Tβ10并诱导表达,对融合蛋白进行功能检测及多克隆抗体制备。结果表明:1)获得了190bp Tβ10基因开放阅读框序列,并获得重组表达载体pDEST17-Tβ10。2)pDEST17-Tβ10在宿主BL21-SI中诱导表达条件为0.3mol/L NaCL诱导2h,获得产物的最终浓度为0.50mg/mL。3)制备的Tβ10蛋白多克隆抗体血清效价在105之上,该抗体可以特异性结合天然和原核表达的Tβ10蛋白。4)离体检测发现,Tβ10融合蛋白一方面可以促进人脐静脉内皮细胞增殖,另一方面可以抑制鹿茸前成软骨区细胞的增殖。综上所述,本研究获得了具有生物活性的Tβ10融合蛋白,并制备了高度特异性的梅花鹿Tβ10蛋白多克隆抗体,为深入研究Tβ10基因的生物学功能奠定了基础。

为获得梅花鹿Ghrelin cDNA全序列,以梅花鹿皱胃黏膜上皮组织提取的总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE法克隆了梅花鹿皱胃中Ghrelin基因cDNA的全序列。结果表明梅花鹿Ghrelin cDNA序列全长为539bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为46bp,3’UTR为128bp,开放阅读框(ORF)为351bp,该ORF编码116个氨基酸残基。将梅花鹿Ghrelin基因的cDNA与人和其他动物的Ghrelin相比,发现:梅花鹿Ghrelin与驯鹿、山羊、绵羊和牛的同源性达90.4%99.

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。

【目的】细菌区系在梅花鹿(Cervus nippon)瘤胃发酵中发挥着重要作用,然而有关梅花鹿瘤胃细菌区系的研究鲜有报道。研究梅花鹿瘤胃细菌区系,为梅花鹿瘤胃发酵调控提供分子生物学依据。【方法】选取4头2岁龄的装有永久性瘤胃瘘管的成年雄性梅花鹿为研究对象,分别饲喂以柞树叶(OL组,梅花鹿A和B)和玉米秸秆(CS组,梅花鹿C和D)为主要粗饲料的日粮,持续饲喂30 d。通过瘤胃瘘管取瘤胃内固液混合物,提取瘤胃微生物基因组DNA。扩增瘤胃细菌16S rRNA基因V3区以及16S rRNA基因,分别用于DGGE和T-RFLP分析。DGGE图谱进行聚类分析,并切取优势条带进行克隆测序,鉴定瘤胃内细菌组成...

研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S...

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NADL株的序列设计并合成1对引物,对从吉林不同地区分离的4株梅花鹿源BVDV(CCSYD株、CC JYD株、CCKCD株和JLCYD株)的N S2-3基因进行RT-PCR扩增,并对扩增的片段进行序列分析。结果表明,国内梅花鹿源BVDV CCSYD株属基因Ib亚型,CC JYD株、CCKCD株和JLCYD株属基因型待定。

为分析梅花鹿KGF基因的生物学特性及其在鹿茸生长不同阶段顶端茸皮组织的表达差异，以雄性梅花鹿茸皮组织为试验材料克隆梅花鹿KGF基因，并采用荧光定量PCR技术对KGF基因在梅花鹿鹿茸顶端不同生长阶段的茸皮组织中的表达量进行差异分析。结果表明：1）成功克隆获得梅花鹿KGF基因的完整编码区，全长为585bp，共编码194个氨基酸；KGF基因编码的蛋白质是具有跨膜结构的不稳定的亲水蛋白，其相对分子质量为22 489.17，理论等电点pI为9.35；二级结构以无规则卷曲为主；2）通过Blastp功能比对显示梅花鹿KGF基因与马鹿、白尾鹿、牛、野牛、山羊的相似性均在99%以上；3）荧光定量PCR结果显示，KGF基因的表达量在梅花鹿鹿茸前期与中期、前期与后期的顶端茸皮组织中差异显著（P0.05）。综上，本研究发现梅花鹿KGF基因在进化中的保守性较高，对鹿茸的生长发育与组织修复有重要作用，其在不同时期茸皮组织中的相对表达量存在差异。本研究为进一步探索鹿茸生长的分子机理奠定基础，为哺乳动物的组织创伤修复提供参考。

应用综合育种值作为数量化育种目标的方法选择梅花鹿的生产性状及其对应的选择性状。在对确定以茸用为主的梅花鹿育种目标时,除了主要考虑茸用性状外,还应适当考虑繁殖和使用寿命等性状,对于直接影响茸鹿生产效益的次级性状不容忽视。借助差额法推导出一系列梅花鹿育种目标中目标性状边际效益的计算方法,并根据调查与研究,给出计算边际效益的有关生物学、育种学和经济学参数,计算出各育种目标性状的边际效益。当这些参数发生变化时,可根据本文给出的计算公式重新计算。根据梅花鹿鹿群的基本情况和对目标性状相对选择重要性的计算结果,认为梅花鹿茸用性状、繁殖性状和使用寿命目标性状的相对选择重要性之比是8∶3∶1,而育种目标中长白山...

【目的】克隆梅花鹿(Cervus nippon)胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列(登录号:HQ890468)设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Ros...

【目的】探明COL1A1（Collagen type I alpha 1 chain，I型胶原蛋白α1链）和COL1A2（Collagen type I alpha 2 chain，I型胶原蛋白α2链）基因在梅花鹿不同组织中的表达谱，解析其对梅花鹿组织发育的影响，为影响梅花鹿重要经济性状的候选基因筛选提供依据。【方法】采用RT-qPCR方法检测COL1A1和COL1A2基因在雄性梅花鹿心脏、肝脏和脾脏等16个组织器官中的表达水平；结合NetPhos 3.1、Motif Search和ProtParam等系列软件预测分析COL1A1和COL1A2基因的生物信息及其在梅花鹿不同组织中的表达谱，并在此基础上构建COL1A1和COL1A2氨基酸序列的系统发育进化树。【结果】COL1A1和COL1A2基因CDS区分别编码1 463和1 364个氨基酸，理论PI分别为5.60和9.19，COL1A1和COL1A2均是一种具有信号肽和磷酸化位点的亲水性稳定蛋白质；二者蛋白二级及三级结构均以无规则卷曲构成；与其他动物相比，鹿COL1A1和COL1A2基因均与反刍动物山羊、绵羊和牛的同源性最高，其中，鹿COL1A1基因与山羊、牛、绵羊的同源性分别为99.5%、99.5%和99.2%，鹿COL1A2基因与牛、绵羊、山羊的同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%，亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示：COL1A1和COL1A2基因在梅花鹿不同组织中均有表达，其中，COL1A1基因在心脏、背最长肌和腿肌中的表达较高，显著高于其他组织，COL1A2基因在心脏、肝脏、肾脏和瓣胃中的表达较高，均显著高于其他组织；此外，COL1A1在肌肉组织中的表达较高，COL1A2较低；二者在其余组织中的表达具有一高一低，相互协同的作用趋势。【结论】COL1A1和COL1A2可能通过相互协同共同维持组织结构及组织发育，相关结果为后续深入研究COL1A1和COL1A2影响梅花鹿生长发育奠定基础。

【目的】研究不同饲养条件下成年公梅花鹿的行为差异。【方法】于2006-04-10及2007-03-10,以江苏省扬州市瘦西湖景区平山堂鹿场圈养的15只成年公梅花鹿和扬州市动物园半散放的13只成年公梅花鹿为研究对象,采用瞬间扫描取样法对其取食、卧息、观望、反刍、移动、修饰、其他行为进行观察,每周观察4d,对收集的数据以60min为单位合并归为一组后进行统计分析,研究2种饲养条件下成年公梅花鹿昼间行为节律。【结果】2种饲养条件梅花鹿群体昼间取食、卧息、观望、反刍、移动、修饰等行为频次所占比例依次减少,其取食、卧息和观望行为频次占昼间行为的80%以上。昼间圈养条件下,梅花鹿有2个取食行为高峰(07:...

为探究COL1A1基因表达的Ⅰ型胶原蛋白α1链在组成生物体结构和骨发育中的重要作用，以梅花鹿茸生长过程的小鞍子（前期）、二杠（中期）和三杈茸（后期）3个典型时期鹿茸顶端组织及其茸皮、间充质、前软骨和软骨4个组织层为试验材料，采用亚硫酸氢盐测序法（BSP技术），从时空角度研究鹿茸生长过程中顶端不同组织COL1A1基因启动子区DNA甲基化模式及其相互间DNA甲基化差异。结果显示：1)COL1A1基因在前、中、后期的茸皮组织中的甲基化率分别为（9.73±0.92）%、（7.60±0.69）%和（3.73±0.23）%；间充质组织中的甲基化率分别为（3.20±0.40）%、（1.33±0.23）%和（1.60±0.69）%；前软骨组织中的甲基化率分别为（4.67±0.83）%、（2.53±0.46）%和（2.67±0.23）%；软骨组织中的甲基化率分别为（5.60±0.40）%、（2.80±0.40）%和（2.27±0.61）%。2)COL1A1基因启动子区的甲基化区域共有25个CG位点，在17个CG位点上均发生了不同程度的甲基化。3）对COL1A1基因启动子区DNA甲基化差异分析发现，相同时期中，茸皮组织甲基化率最高，间充质组织甲基化率最低；相同组织中，中期比前期显著下调；CG位点的比较中，前期与中期的CG位点差异程度较大。综上，COL1A1基因在快速生长期，以及在间充质组织、前软骨组织、软骨组织中对鹿茸生长具有促进作用。在DNA甲基化水平上探究梅花鹿鹿茸不同组织的时空表观遗传差异，为鹿茸快速生长与骨化机制的研究，以及哺乳动物组织再生和器官修复等领域的研究提供了科学参考。

于紫色花和白粉色花鹿角杜鹃开花过程中全绿期、露红期、初花期、盛开期，采用超高效液相色谱–串联质谱技术，测定鹿角杜鹃花瓣代谢物的含量；通过正交偏最小二乘判别法(OPLS–DA)分析筛选出差异代谢物，利用KEGG数据库对差异代谢物进行富集分析，进一步筛选与花色相关的关键代谢物，通过相关性分析验证关键代谢物与鹿角杜鹃花色的相关性。结果表明：在鹿角杜鹃的花瓣中共检测到1057种代谢物，其中差异代谢物243种，差异代谢物在类黄酮和花青素代谢通路中显著富集；紫色花鹿角杜鹃花瓣中锦葵色素–3–O–葡萄糖苷的含量远高于白粉色花鹿角杜鹃的。推测锦葵色素–3–O–葡萄糖苷是鹿角杜鹃花瓣呈紫色的关键花青苷，二氢杨梅素和没食子儿茶素可能通过类黄酮合成通路影响鹿角杜鹃花青素的合成，进而影响鹿角杜鹃的花色。