为研究供体细胞不同处理方法对核移植重构胚发育能力的影响,分别用血清饥饿不同时间和传代次数的供体细胞进行核移植,比较重组胚的卵裂率和囊胚率.结果发现,饥饿0、2、4、8d的核供体细胞,重组胚在卵裂率上没有表现显著的差异,而饥饿2d和4d试验组的囊胚率却显著高于其他组;以传代0、2、4、8代的细胞作为供体细胞进行核移植,未经传代的细胞直接作为核供体卵裂率为57.69%,明显低于经过传代的细胞;细胞的传代次数在重组胚卵裂率上并未表现出明显的不同,但传至第4代细胞构成重组胚的卵裂率和囊胚率最高(86.29%和23.36%).试验选取饥饿处理2d、传4代的成纤维细胞作为核移植的供体,挑选发育良好的重组胚...

将德保矮马耳缘组织经胶原酶消化法培养成原代细胞,并成功建立起该组织成纤维细胞系。这种细胞贴壁生长,具有密度接触性抑制性质;该方法获得的原代细胞经传代后接种,细胞群体倍增时间(PDT)为35.9h;细胞染色体众数2n=64的细胞数占91.3%～92.8%;乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶分析,没有其它细胞系污染;细菌、真菌、病毒、支原体检测阴性。该系符合ATCC要求的细胞系鉴定项目,成为保护矮马这一国家重要畜禽品种的宝贵遗传资源,并为相关遗传学研究提供了有效的试验材料。同时得出胶原酶消化培养法比组织块培养法在获得原代细胞速度快;组织块培养法的细胞群体倍增时间(PDT)为48h。

为了探讨丝裂酶素C处理后鼠胚成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)活力的变化规律,试验用10μg/mL丝裂酶素C处理MEF,研究丝裂酶素C处理时间及其处理后细胞接种量、血清浓度和细胞代次对MEF活力的影响。结果表明,用10μg/mL丝裂酶素C处理2和3 h,MEF活力比处理4 h的稳定,处理2 h的MEF活力与处理3 h的没有显著差异;用10μg/mL丝裂酶素C处理3 h后,MEF以(0.8~1.6)×104/孔接种96孔板,其活力比2.0×104/孔和4.0×104/孔接种的稳定;用含体积分数10%犊牛血清培养液培养的MEF活力,比用含体积分数2%,5%,...

分离牛卵母细胞,分别用添加表皮生长因子(EGF)和发情牛血清(发情当天血清(OCS(0 d))和发情第7天血清(OCS(7 d)))的培养液进行成熟培养后去核,构建牛体细胞核移植胚并进行体外培养,研究EGF和OCS对卵母细胞成熟及核移植胚体外发育的影响。结果表明EGF添加组和OCS(0 d)添加组卵细胞的成熟率及核移植胚的卵裂率和囊胚率分别为74.5%,84.6%,25.9%和83.9%,78.8%,31.3%。在牛卵母细胞成熟液中添加EGF、OCS(0 d)更有利于牛核移植胚胎的发育。

【目的】获得敲除肌肉生长抑制素(MSTN)基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建:以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5382bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250μg·ml-1G418筛选7d,再用200μg·ml-1G418+2μmol·L-1GANC维持筛选...

将安全浓度范围内的黄芪多糖、当归多糖、蜂胶多糖、淫羊藿多糖、板蓝根多糖、黄芪黄酮、蜂胶黄酮、淫羊藿黄酮、黄芪皂苷和人参皂苷等 10种中药成分分别加入已培养 2 4h、刚形成单层的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中 ,在加药后12 ,2 4 ,36 ,4 8和 6 0h用MTT法测定它们对CEF增殖的影响。结果表明 ,黄芪皂苷、黄芪多糖、板蓝根多糖和蜂胶黄酮主要表现为促进增殖 ;淫羊藿多糖主要具抑制效应 ;其他 5种中药成分在某些浓度和时间点能促进增殖 ,而在某些浓度和时间点则抑制增殖 ,并有一定的量效和时效关系。

旨在研究羔羊、胎儿成纤维细胞、绵羊类胚胎干细胞及处理方式对核移植效率的影响。比较了羔羊皮肤成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;胎儿成纤维细胞饥饿及消化后平衡时间对细胞可用率的影响;羔羊成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、类胚胎干细胞在可用率及对融合率的差异和类胚胎干细胞与转基因羔羊皮肤成纤维细胞对核移植效率的影响。结果表明,饥饿对胎儿成纤维细胞可用率影响不大(P>0.05),但平衡时间影响极大(P<0.01);饥饿及平衡时间对胎儿成纤维细胞影响都很显著(P<0.01);胎儿成纤维细胞的可用率极显著高于类胚胎干细胞和羔羊皮肤成纤维细胞(P<0.01),融合率显著高于羔羊(P<0.05),但...

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。

为评价中药“病毒克”颗粒剂体外抗新城疫病毒(NDV)的活性,采用细胞培养技术,通过细胞病变抑制法和MTT比色法检测“病毒克”颗粒剂在鸡胚成纤维细胞(CEF)中对新城疫病毒增殖的影响。结果表明“病毒克”颗粒剂对CEF的半数中毒质量浓度(TC50)为61.35 mg/mL,抗NDV的半数有效质量浓度(EC50)为3.2 mg/mL,治疗指数(TI)为19.2,“病毒克”颗粒剂对新城疫病毒具有直接灭活作用和阻断其感染CEF的作用,并存在明显的量效关系(P

用氯磺酸-吡啶法修饰当归多糖(CAPS)和枸杞多糖(LBPS),得到4种硫酸化当归多糖sCAPS0.6、sCAPS1.1、sCAPS1.9、sCAPS2.2和4种硫酸化枸杞多糖sLBPS0.7、sLBPS1.1、sLBPS1.5和sLBPS1.9。分别以CAPS和LBPS为对照,采用MTT法比较了这8种硫酸化多糖对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响。结果表明:硫酸化修饰能显著提高当归多糖和枸杞多糖的抗病毒活性,且与硫酸基取代度有一定的相关性。sCAPS2.2、sLBPS1.5、sCAPS1.9和sLBPS1.9的活性较好,可以作为进一步研究的材料。

为获得适合于克隆麋鹿的供体细胞,本试验对麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养、纯化、生长特征、核型分析和冷冻保护剂等进行了研究。通过组织块培养法获得麋鹿皮肤成纤维细胞,用胰酶轻度消化后传代3~4次可得到较纯的皮肤成纤维细胞,并经过免疫荧光鉴定;麋鹿染色体数目为2n=68,核型式为2(M)+64(A),XY(A,M);含10%NCS的DMEM培养基最适宜细胞生长;复苏后可获得87.78%的贴壁率。

本研究首先利用组织块培养法成功分离培养了蒙山牛耳皮肤成纤维细胞,接着对培养的细胞进行了传代培养和冷冻保存及复苏检测,然后对细胞进行了形态观察和生长曲线测定,最后分别对不同汇合程度和不同保存时间细胞的核型正常率和细胞周期进行分析。结果表明,培养的细胞具有典型的成纤维细胞形态,具有正常的分裂增殖特性,没有转化倾向。在处于S期细胞数目上,60%~70%和80%~90%汇合程度组差异不显著,但显著高于90%~100%汇合程度组(P<0.05)。而在处于G0+G1期细胞数目上,60%~70%和80%~90%汇合程度组显著低于90%~100%汇合程度组(P<0.05)。冷冻保存1个月和3个月组细胞复苏率显...

以版纳微型猪近交系妊娠47d的胎儿为材料,采用胰蛋白酶消化法消化培养胎儿成纤维细胞,对其进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制和染色体核型分析等生物学特征检测.结果表明,培养的版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后的存活率分别为98.06%和92.12%;生长曲线呈"S"形,倍增时间为36h;对所制备染色体核型进行分析,显示2n=38,XY,并在体外培养14个代次后仍能保持正常核型.

【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM~?830/NEPA21/Nucleofector~(TM)2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10~6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector~(TM) 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM~?830和Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM~?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector~(TM) 2b。

为了建立广西巴马小型猪附睾成纤维细胞体外培养体系,利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离附睾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏,并通过接触抑制和解除抑制研究细胞的增殖能力,以及通过免疫荧光对其进行鉴定。结果表明,该法成功分离获得广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,并可以大量传代和冷冻,目前已经传至55代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性。可见,通过微量液体组织块贴壁法能成功分离得到广西巴马小型猪附睾成纤维细胞,在体外能稳定培养和传代。