用HrpNEa处理拟南芥(Arabidopsis)时发现核孔蛋白At1G59660基因的表达被抑制。因该基因编码的蛋白质与哺乳动物中的核孔蛋白(nucleoporin98)具有相似性质,具有FG(pheny lalanine-glycine)重复基序,故命名为Atnup98-like。同时对野生型和Atnup98-like突变体植株分别进行病原细菌Psyringae syringae pv.tomato DC3000接种及干旱处理,结果发现突变体植株对DC3000的抗性明显增强,而且突变体中抗病相关基因PR1a的表达明显强于野生型;同时,突变体植株比野生型植株抗旱性增强,脯氨酸含量明显升高,且...

ROP蛋白是植物特有的一类小G蛋白,在植物信号传导途径中起重要作用.拟南芥共编码11种ROP蛋白,为明确ROP蛋白在拟南芥抗病反应中的作用,将病原细菌Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000接种于各AtROP的激活和失活突变体后,观察其增殖情况.结果表明,AtROP2和AtROP11抑制病原菌的增殖,而AtROP10则促进病原菌的增殖,其他At-ROP对Pst.DC3000的增殖没有影响.

为了进一步挖掘拟南芥LBD逆境胁迫响应基因在植物非生物逆境胁迫应答中的作用,探究拟南芥逆境胁迫响应机理,将前期筛选到的LBD15基因构建到pGBKT7酵母表达载体上,筛选与LBD15互作的蛋白。利用酵母双杂交技术筛选了拟南芥全长均一化的酵母文库,在本次筛库试验中,146个样有107个测出序列,通过NCBI Blast分析,其中有96个获得了基因号,占总数的87.9%。根据基因号进行分类,得到了48个蛋白,在筛选到的48个蛋白中有59%的蛋白都是有重复的。然后把基因号通过网站TAIR(www.arabidopsis.org/index.jsp)查找其蛋白序列,通过亚细胞定位预测网站(http://cello.life.nctu.edu.tw/)分析其亚细胞定位,定位分析结果表明,这些蛋白主要定位于叶绿体、细胞质和细胞核。利用Blast2GO进行Gene Ontology注释显示互作蛋白共参与了14个生物过程,包括细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控、单组织和多组织过程及发育进程调控等。对得到的可能互作蛋白随机挑选了5个进行了互作蛋白的分离和回复验证,结果发现,AP19蛋白及其他一些蛋白的菌落能够在营养缺陷型的平板上正常生长,进一步证实了其为互作蛋白。酵母双杂交文库的成功筛选为进一步研究拟南芥LBD15的分子作用机制奠定了基础。

EPF/EPFL基因家族成员编码一类富含半胱氨酸的分泌型小肽，本研究通过实时荧光定量PCR检测、核盘菌接种和二氨基联苯胺(DAB)染色分析11个EPF/EPFL基因在拟南芥对核盘菌防御反应中的作用.荧光定量PCR分析显示，接种核盘菌后，EPFL1、EPFL2、EPFL3、EPFL4、EPFL5、EPFL6和EPFL9的表达水平至少在一个时间点明显上调.核盘菌接种处理后，epfl1、epfl2、epfl3、epfl4、epfl5、epfl6和epfl9拟南芥单突变体叶片的病斑面积与野生型拟南芥(WT)相似，且DAB染色显示的H_2O_2含量也与WT没有明显的差别；epfl1,2,4,6四突变体拟南芥叶片的病斑面积明显大于WT.DAB染色结果显示，与WT相比，epfl1,2,4,6四突变体拟南芥的H_2O_2含量明显增多.荧光定量PCR结果进一步显示，与WT相比，核盘菌抗病相关基因YDDs在epfl1,2,4,6四突变体拟南芥接种核盘菌前后的表达量均明显下调.这说明EPFL1、EPFL2、EPFL4和EPFL6在拟南芥应答核盘菌的防御反应过程中存在冗余功能，通过介导YDDs基因的表达，共同调控植物免疫反应.

【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。

【目的】了解异三聚体G蛋白在紫外线B(UV-B)辐射诱导气孔关闭中的作用,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型、G蛋白α亚基基因缺失突变体及其超表达株系和组成活化型株系为材料,并结合药理学试验,通过气孔开度分析确定G蛋白在0.5 W.m-2UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭中的作用。【结果】细菌毒素试验表明,G蛋白抑制剂百日咳毒素(PTX)能显著抑制UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素(CTX)能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭。遗传学试验显示,UV-B不能诱导异三聚体G蛋白α亚基GPA1功能...

【目的】获得转金属硫蛋白（ＭＴ）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产ＭＴ奠定基础。【方法】利用融合ＰＣＲ方法，扩增拟南芥ＭＴ基因与油体蛋白ｏｌｅｏｓｉｎ基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体ＰｏＰ上，构建重组质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ。采用冻融法将质粒ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ转入根癌农杆菌ｅＨＡ１０５中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用ＰＣＲ检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用ｓＤｓＰＡＧｅ法检测ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体ＰｏＰｏｌｅｏｓｉｎＭＴ，融合蛋白ｏｌｅｏｓｉｎＭＴ在拟南．．．

【目的】获得转金属硫蛋白（MT）基因的拟南芥植株，为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法，扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因，将融合基因克隆至表达载体pOP上，构建重组质粒pOPoleosinMT。采用冻融法将质粒pOPoleosinMT转入根癌农杆菌EHA105中，通过农杆菌介导法转化拟南芥，用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株，采用SDSPAGE法检测oleosinMT融合蛋白的表达，邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOPoleosinMT,融合蛋白oleosinMT在拟南...

对拟南芥SDG26基因功能缺失突变体sdg26植株和对照野生型Col植株在干旱条件下的SOD活性和MDA、可溶性糖、脯氨酸含量进行测定。结果显示:随着干旱时间(5、8、11、14、17、20 d)持续,sdg26植株中的SOD活性和MDA、可溶性糖、脯氨酸含量都表现出明显提高的趋势,上升水平显著高于对照野生型Col植株;在持续干旱20 d条件下,Col植株的叶片逐渐失水干枯及至死亡,但sdg26植株能正常生长,表现出良好的生长势,推测SDG26基因功能的丧失可以增强拟南芥的抗旱能力,说明植物的抗旱能力与组蛋白的甲基化修饰密切相关。

将原核表达、纯化的Ran2蛋白对新西兰兔进行免疫制备抗血清,ELISA测定其效价为1∶51 200。免疫印迹分析表明,原核表达、纯化的Ran2和拟南芥可溶性蛋白杂交带均在26 ku处。FITC荧光标记抗体检测Ran2绿色杂交带主要出现在细胞分裂间期的核膜上。

利用酵母双杂交技术,鉴定拟南芥抗病相关基因T1N6-22的互作蛋白,为进一步明确T1N6-22基因调控拟南芥抗病的分子机制奠定基础。利用Gateway技术,构建T1N6-22基因及其候选互作蛋白基因的酵母双杂交载体AD-T1N6-22、AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480、BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480。将空载的AD载体分别与BD-T1N6-22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合共同转化酵母感受态细胞,检测各基因的自激活活性,发现T1N6-22、AT1G21400、AT2G19480基因无自激活活性,AT1G06050基因有自激活活性。将AD-T1N6-22载体分别与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480载体组合,BD-T1N6-22载体分别与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480载体组合,进行酵母双杂交试验。结果发现,AD-T1N6-22与BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480,BD-T1N6-22与AD-AT1G06050、AD-AT1G21400、AD-AT2G19480共转化的酵母细胞在二缺(-Leu/-Trp)、三缺(-Leu/-Trp/-His)和四缺(-Leu/-Trp/-His/-Ade)培养基上均可以生长,表明T1N6-22与AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480在酵母细胞中直接互作。

【目的】从‘富士’苹果中克隆MdWRKY40,研究其在水杨酸(SA)诱导条件下的表达模式及在苹果轮纹病抗病信号通路中的作用,为进一步揭示苹果的抗病机制提供理论依据。【方法】以‘富士’苹果为试材,克隆MdWRKY40的全长CDS序列,对其进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在苹果各组织中的表达水平,及对非生物胁迫SA的响应;研究外源SA处理对苹果叶片接种轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)的影响,并利用qRT-PCR检测病程相关蛋白基因的表达;将MdWRKY40在拟南芥中进行异源表达,对稳定表达的拟南芥幼苗叶片进行接菌处理,观察叶片发病程度及发病叶片数量,并采用qRT-PCR分析病程相关基因的表达;测量拟南芥幼苗的根系长度,并利用qRT-PCR检测生长素相关基因的表达。【结果】MdWRKY40包含长为858 bp完整的开放阅读框,编码286个氨基酸,预测其分子量为32.088 kD,等电点为8.15。系统进化树分析表明,MdWRKY40与白梨PbWRKY40序列相似性最高,亲缘关系最近,与拟南芥AtWRKY40在不同的分支上,亲缘关系较远,利用DANMAN软件进行MdWRKY40与AtWRKY40的多序列比对分析发现,MdWRKY40蛋白与AtWRKY40蛋白虽然都含有一个WRKYGQK保守结构域,但相似度仅为29.78%。qRT-PCR分析表明,MdWRKY40在根中的表达水平最高,在叶中的表达水平最低,并且在根、茎、叶中,SA均诱导了MdWRKY40的表达,且均呈现先升高后降低的趋势,在6 h时表达量最高;外源SA处理提高了苹果叶片对轮纹病菌的抗性,未处理的叶片发病率达92.59%,SA处理后发病率降至79.26%,并显著提高了病程相关蛋白基因MdPR2、MdPR5的表达量。与野生型相比,在拟南芥中异源过量表达MdWRKY40显著提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,野生型拟南芥发病率达77.5%,而两个转基因拟南芥株系发病率仅为21.5%和17.4%,并显著提高了病程相关基因PR1、PR3、PR4的表达。过表达MdWRKY40的拟南芥植株根系生长受到抑制,培养7 d后转基因拟南芥主根长度分别是野生型拟南芥的39.9%和43.1%,培养10 d后主根长度分别是野生型拟南芥的58.5%和55.4%。基因表达结果显示,生长素合成相关基因AtTAA1和生长素运输相关基因AtPIN1、AtPIN2的表达水平在MdWRKY40过表达株系中显著低于野生型。【结论】MdWRKY40表达受SA和苹果轮纹病菌侵染诱导;MdWRKY40是苹果中重要的轮纹病抗病基因,该基因过表达显著提高对轮纹病菌的抗性;MdWRKY40具有调控植物根系生长发育的功能,可能通过下调生长素运输相关基因的表达影响植物根系生长发育。

【目的】获得转金属硫蛋白(MT)基因的拟南芥植株,为利用植物生物反应器规模化生产MT奠定基础。【方法】利用融合PCR方法,扩增拟南芥MT基因与油体蛋白oleosin基因的融合基因,将融合基因克隆至表达载体pOP上,构建重组质粒pOP-oleosin-MT。采用冻融法将质粒pOP-oleosin-MT转入根癌农杆菌EHA105中,通过农杆菌介导法转化拟南芥,用PCR检测并筛选转基因拟南芥阳性植株,采用SDS-PAGE法检测oleosin-MT融合蛋白的表达,用邻苯三酚自氧化法和结晶紫法测定融合蛋白的体外抗氧化活性。【结果】成功构建了植物油体特异表达载体pOP-oleosin-MT,融合蛋白ole...

分别采用RT-PCR和直接荧光免疫方法分析Ran2 mRNA在拟南芥不同组织器官中的表达及Ran2的亚细胞定位。结果表明,Ran2基因在拟南芥根、茎、叶和花中均有表达;Ran2蛋白在细胞分裂间期主要定位于核膜周边,在后期定位于赤道板上和纺锤体上,末期又回到子细胞核膜周边。