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[期刊] 中国农业科学
[作者]
叶湘漓 夏立秋
【目的】利用核型多角体病毒(NPV)的p74基因与苏云金芽胞杆菌(Bt)的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌【。方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
蒋冬花 邓日强 庞义 余健秀 龙綮新
选用土壤新分离株Ｓ１８－４为供体菌，以ＰＨＴ３１０１穿梭质粒为载体，载体和供体ＤＮＡ用Ｐｓｔｌ酶切后进行连接，用电激法将重组质粒转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ·ＢＥ２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察，证明δ－内毒素基因得到了表达，并具有很高的表达量。生物测定结果显示，重组株对夜蛾科幼虫具有比野生株Ｓ１８－４更强的杀虫毒性。
关键词：
苏云金芽孢杆菌 δ-内毒素 克隆 表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王强 陈克平 郭忠建 姚勤 王海燕 陈慧卿
【目的】利用BmNPV的Bac-to-Bac系统快速表达目的基因orf90,为深入研究该基因打下基础。【方法】将目的基因BmNPVorf90克隆到转移载体pFasBacHTb上,并将报告基因egfp插入到orf90的3'末端,形成重组转移载体pFasBacHTb-egfp-90。在将其转化到含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过转座作用,经白斑筛选得到重组穿梭载体。纯化DNA,用脂质体介导转染家蚕BmN细胞,得到重组病毒bacmid-egfp-90。【结果】转染细胞72h后在荧光显微镜下可以观察到强烈的绿色荧光。重组病毒穿刺接种家蚕蛹,5d后观察到很强的荧光。结果表明构建的B...
[期刊] 水产学报
[作者]
李丹蕾 郝少彦 张亦陈 耿绪云 刘逸尘 孙金生
为了分析凡纳滨对虾JAK (Lv-JAK)和STAT (Lv-STAT)基因应答病原菌侵染的表达变化特征,本实验利用半定量PCR技术分析了Lv-JAK和Lv-STAT基因的组织表达特征,并利用实时荧光定量PCR技术分析了其在苏云金芽孢杆菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-JAK和Lv-STAT基因在凡纳滨对虾的9种组织中有不同程度的表达,均在鳃、肠道和心脏中表达量较高。苏云金芽孢杆菌感染后,在鳃组织中,Lv-JAK和Lv-STAT基因的相对表达量在感染的中晚期(24～72 h)显著上调表达;在肠道组织中,Lv-JAK基因的相对表达量在感染后的6和24 h显著上调,Lv-STAT基因的相对表达量在感染后的24和72 h显著上调。综上表明,JAK和STAT基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由苏云金芽孢杆菌引发的天然免疫应答过程,探讨凡纳滨对虾JAK和STAT基因应答苏云金芽孢杆菌感染的表达变化特征,有助于研究对虾JAK/STAT通路在应答病原菌侵染过程中的功能和作用机制。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨兆辉 汪子洋 杨文涛 蔡瑜婷 谭伟龙 黄恩炯 张灵玲
乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
鲁絮 张彦明 许信刚
采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。
关键词：
猪瘟病毒 NS3基因 大肠杆菌
[期刊] 中国农业科学
[作者]
邵铁梅 宋福平 李卓夫 张杰 姜声华 刘大群 黄大昉
通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌,其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌(Erwiniaherbicola)的抑菌活性,结果表明有67株菌有抑菌活性,其中21株抑菌活性较高。经鉴定,抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因,并从G03中克隆了zmaR全长基因,完成了序列测定。该基因编码区为1125bp,由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个,分子量为43.5kD,等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21,可正常表达43.5kD蛋白,并使宿主菌产...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴怀光 叶伟星 喻子牛 孙明
【目的】摸索提高AiiA蛋白对AHLs分子的降解活性和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生病害的抑制能力的方法。【方法】苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白是一种胞内蛋白,能降解参与诱导调控多种植物病原菌致病基因表达的N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子。本文采用两种方式来提高AiiA蛋白的活性,即利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白在细胞表面表达该蛋白以及利用苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子来提高aiiA基因的表达量。为此构建该蛋白基因与细胞表面S-层蛋白的锚定区结合而成的融合蛋白基因slh-aiiA以及带有基因cry3Aa启动子的融合基因pro3A-aiiA。为了提高表达的稳定性以及去掉重组菌中非苏...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张守涛 史婧 李楠 郭蔼光
根据蛇毒纤溶酶(A lfim eprase,ALF)氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,设计了14条单链DNA,采用重叠延伸PCR方法人工合成了ALF基因编码区。通过克隆使其分别连接在融合标签N usA,T h ioredox-in,Skp,H is T ag和信号肽pe lB的C端,构建成了多种ALF表达载体p43-A lf,p25-A lf,p32-A lf,p15-A lf和pSkp-A lf,转化大肠杆菌后进行了诱导表达,并对表达产物进行了SDD-PAGE分析。实验结果表明,合成的ALF基因长度为603 bp;构建的表达载体在大肠杆菌中均获得了很好的表达,其中pSkp-A lf表达量最高...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
洪玉枝 刘子铎 汤江武 喻子牛
将苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白ＣｒｙⅠＡ基因的高保守区ＥｃｏＲＩ－Ｆ片段重组到ｐＳＥＬＥＣＴ－１载体的ＥｃｏＲＩ位点，构建出能够高效转录ＲＮＡ的探针载体ｐＳＢＰＬ－１。该载体在Ｔ７ＲＮＡ聚合酶作用下，通过ＤＩＧ体外标记转录制备的ＲＮＡ探针，具有灵敏度高，背景清楚，省时等优点，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究，及对鳞翅目有特异毒性高效菌株的筛选提供了一种方便而有效的方法。
关键词：
苏云金芽胞杆菌 体外转录 RNA探针载体
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
季思思 朱义广 彭东海 阮丽芳 孙明
利用特异引物从基因组BAC文库筛选到1个35kb的片段,对该片段测序比对分析发现可能含有p26的复制区。为了验证该片段中是否含有p26的复制区,首先,将大肠杆菌和苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT304用EcoRⅠ酶切切掉苏云金芽胞杆菌复制子后自连,获得复制子克隆载体pHT304E;随后,将12kbEcoRⅠ片段亚克隆到载体pHT304E上电转化无晶体突变株BMB171,获得具有抗性的转化子,证明该片段具有复制功能。缺失实验证明最小复制功能区包含2个必需的ORF。经过40代无抗培养,最小复制区复制稳定性达到90%以上。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
韩研妍 姜平 顾小雪 李玉峰
在分析脑心肌炎病毒VP1蛋白抗原表位基础上人工合成一段含VP1抗原表位双链DNA序列(150 bp),克隆于原核表达载体pGEX-6p-1,经酶切鉴定后转化大肠杆菌(E.coli)BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。经过GSTrap FF亲和层析柱获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳显示相对分子质量为30 800。以该纯化蛋白免疫家兔,获得效价分别为1∶25 600和1∶1 600的抗血清。W estern-b lot结果显示该融合蛋白与经过空载体pGEX-6p-1表达的GST蛋白孵育的抗血清反应后有明显的特异性条带。结果表明:脑心肌炎病毒VP1蛋白...
[期刊] 华北农学报
[作者]
宋萍 郭丽伟 苏俊平 王勤英 王晖
对我室所保存的18株含cry7类基因的菌株进行晶体形状、生物活性和蛋白型基因型等进行分析。结果表明:这些菌株能产生菱形、小菱形和不规则形伴胞晶体,SDS-PAGE检测主要蛋白的分子量是130kDa,PCR扩增得到1300bp条带。对马铃薯瓢虫二龄幼虫的生物活性测定结果表明,菌株WZ-9具有很高的杀虫率,72h校正死亡率达到了93.1%;菌株WCG-10活性次之,72h校正死亡率达到44.8%,而其他菌株杀虫活性低或没有活性。对杀虫活性最高的WZ-9菌株扩增全长基因,得到cry7Ab3基因(GenBank Number:BI1015188)。
[期刊] 华北农学报
[作者]
吴会贤 宋萍 王勤英 苏旭东
通过醋酸钠-抗生素筛选法从河北省土壤中筛选得到了苏云金芽孢杆菌新菌株CY1。镜检可观察到伴孢晶体呈小菱形。SDS-PAGE分析结果表明菌株CY1表达的晶体蛋白分子量为130 kDa。利用25对通用引物检测cry1,cry1I,cry7,cry2,cry3,cry4/cry10,cry5,cry6,cry7,cry8,cry9,cry11,cry13/14,cry16/17,cry18,cry19,cry21,cry22,cry24/25,cry26/28,cry27/29,cry30,cry32,cry34/35,cry40基因,仅从CY1菌株中检测出cry7基因,该cry7基因N末端的1 2...
关键词：
苏云金芽胞杆菌 CY1菌株 cry7基因
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
张淑霞 贺秀媛 崔保安 王建华
鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白(N)基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL-p2X,构建重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达。通过pMALTM融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA法检测其生物活性。结果表明,表达的重组核蛋门纯化后出现2条带,相对分子质量分别约为92和82 ku,与Western blot出现的2条蛋白带一致;纯化的重组蛋白经裂解因子作用后,出现2条蛋白带,相对分子质量分别为45和35 ku,与...
关键词：
鸡传染性支气管炎病毒 N基因 免疫活性
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