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[期刊] 中国水产科学
[作者]
张立强 谢海侠 李楠 聂品
利用PCR方法从柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)G4株中克隆了1个胶原蛋白酶基因(GenBank登录号EF501979)。同源性比对发现该基因与柱状黄杆菌的另外1种胶原酶基因(GenBank登录号EAZ95511.1)最为相近,有84%的一致性和93%的相似性。该属的另外2种细菌,约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)和嗜冷黄杆菌(F.psychrophilum)都有与该胶原酶基因相似的基因,其相似性分别为92%和83%。该基因经KpnI和SalI酶切后连接到表达载体pET-32a上,转入大肠杆菌BL21(DE3)plysS内进行表达,经...
关键词：
柱状黄杆菌 胶原蛋白酶 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邹智 杨礼富
半胱氨酸蛋白酶是一类重要蛋白水解酶,其广泛参与植物的生长发育及各种生物与非生物胁迫的应答。根据EST序列信息设计引物,从橡胶树的根中分离到1条1 056 bp的c DNA。该序列包含1个1 023 bp的开放阅读框(ORF),13 bp的5'UTR和20 bp的3'UTR。ORF预测编码340个氨基酸,相对分子质量为37 350,等电点为5.24,属于液泡定位的分泌型蛋白。该蛋白含有1个Inhibitor_I29和1个Peptidase_C1A结构域,可归为木瓜蛋白酶C1家族。该蛋白与蓖麻(Ricinus communis)和杨树(Populus trichocarpa)中同源蛋白的相似性都在...
关键词：
橡胶树 半胱氨酸蛋白酶 根特异性表达
[期刊] 水产学报
[作者]
刘海燕 杨汝晴 陈玉磊 张凌晶 孙乐常 刘光明 曹敏杰
为探究大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）的性质。本研究采用生物信息学方法对大黄鱼MBSP进行基因检索与筛选，通过分子克隆得到大黄鱼MBSP编码区全长cDNA并构建毕赤酵母表达系统得到重组蛋白质（Lc-rMBSP），分析Lc-rMBSP的酶学性质和二级结构并通过同源建模分析Lc-MBSP的三级结构。结果显示，大黄鱼肌原纤维蛋白中存在MBSP，在55 ℃下活性最高。大黄鱼基因组中注释为类胰蛋白酶的基因有16条，对这些基因与淡水鱼MBSP进行系统进化树分析和多序列比对，得到同源性较高的基因序列（Lc-MBSP）。Lc-MBSP编码区全长735 bp，共编码244个氨基酸残基。通过毕赤酵母重组表达，分离纯化得到分子量约28 ku的重组蛋白质Lc-rMBSP。表达蛋白的最适温度和pH分别为50 ℃和8.0。圆二色谱分析表明，温度对Lc-rMBSP二级结构具有较大的影响。Lc-rMBSP在较宽的温度范围内（40～60 ℃）对MHC具有较高的水解活性。Lc-rMBSP的最适底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA，并且特异性切割羧基侧的精氨酸残基，而不分解赖氨酸残基。通过同源建模得到Lc-MBSP的三维结构，催化三联体由保守的His-61、Asp-105和Ser-198构成，其底物结合口袋（Ser-192、Gly-215和Ser-225）与类胰蛋白酶的略有不同，这种差异可能是导致Lc-rMBSP与其他胰蛋白酶酶学性质不同的主要原因。本研究可为海水鱼MBSP的研究提供理论参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
连凯琪 纪爽 周玲玲 时志琪 王飞 张元臣
为了克隆黏虫丝氨酸蛋白酶的全基因序列，并进行原核表达，以黏虫为研究对象，利用RT-PCR扩增丝氨酸蛋白酶的部分基因，进而通过RACE技术，得到丝氨酸蛋白酶全基因，通过Blast等软件对获得基因序列和推导的蛋白质序列进行分析，并利用大肠杆菌表达系统对其进行表达。结果表明，成功克隆黏虫丝氨酸蛋白酶全基因，将其命名为MsPG,序列全长2 010 bp,开放阅读框为1 593 bp,编码530个氨基酸，蛋白质分子质量为67.6 ku,等电点为7.63,且具有含6个半胱氨酸的clip结构域，推测其为clip型丝氨酸蛋白酶。MsPG氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫序列一致性在70.00%～91.92%,其中与烟芽夜蛾(GenBank登录号：PCG78401.1)序列一致性最高，达到91.92%。成功构建重组质粒pET30a(+)-MsPG,其在大肠杆菌原核表达系统中0.1 mmol/L IPTG诱导下的最佳表达温度是25℃。综上，黏虫丝氨酸蛋白酶MsPG具有丝氨酸蛋白酶家族保守的功能位点，且能够在体外进行原核表达。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
罗维 余兴龙 白霞 李润成 侯强红 尹恒
根据Z26520中fedF序列设计1对引物,从发病仔猪的腹泻粪便分离获得的大肠杆菌中扩增得到fedF基因,经纯化、连接、转化,将其成功克隆到pMD18-T中,所克隆fedF基因序列与GenBank中收录的其他fedF基因序列的同源性达97.8%～99.2%.另设计1对引物,利用基因工程方法将所克隆的fedF的编码序列亚克隆到表达载体pBV220中,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达重组菌.测序结果表明,插入编码序列与预期序列一致.SDS-PAGE电泳及Western-blotting分析表明,重组菌在诱导后可以表达特异性的相对分子质量为30 100的FedF蛋白.
关键词：
大肠杆菌 fedF基因 克隆 表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
刘国勇 聂品
柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原。本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3。对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株"。利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马晓轩 范代娣 刘树文 骆艳娥
采用补料一分批式发酵,研究了4种不同间歇周期补氮操作对细胞生长和类人胶原蛋白表达的影响,以及发酵过程中细胞质粒稳定性、细胞菌落形成能力和乙酸生成量的变化。结果表明,在每隔10min连续补加 36mL补料氮溶液(22s完成补加操作)的周期操作下,细胞质粒稳定性明显提高,细胞菌落形成能力下降较小,乙酸生成量低,仅0．7 g／L,最终细胞密度为84 g／L,类人胶原蛋白表达量可达到14 g／L,在4种操作方式中最高。
[期刊] 华北农学报
[作者]
叶飞 张培君 田德雨 徐慧 孙慧玲 王宏俊 龚玉梅 贺云霞
副猪嗜血杆菌病(Haemophilus parasuis)是规模化猪场的重要细菌性疾病之一。对已发表的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子量大约为41 kDa,利用基因工程的方法将该基因片段定向克隆至表达载体pGEX-6p-1中,诱导表达后的分子量约为67 kDa。该研究为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。
关键词：
副猪嗜血杆菌 ompP5 克隆 表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱春平 李燕 吴亚丽 常婧竹 刘琳 高文明 李新生
【目的】克隆和表达H3N2型猪流感病毒(SIV)A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的核蛋白(NP)基因,为制备NP抗体和SIV基因工程疫苗奠定基础。【方法】提取SIV A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的RNA,用RT-PCR扩增NP基因,将其定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体,构建重组表达载体,并将其转化入大肠杆菌Rosetta中表达,用SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物,同时考察IPTG不同浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)和不同诱导时间(2,4,6,8h)对重组NP蛋白表达量的影响。【结果】克...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
古英洪 汤浩茹 张义正
【目的】克隆桃(Prunus persica)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
刘国勇 陈发菊 聂品
为了鉴定柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)的毒力相关因子,利用蛋白质组学方法分析了强毒株G4R3和弱毒株G18的外膜蛋白。双向电泳结合图像分析,共发现了8个差异表达的蛋白点。经过胶内酶解和质谱分析,其中的1个蛋白点被鉴定为LemA蛋白,它可能是柱状黄杆菌的一种毒力因子。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
黄天培 潘洁茹 李今煜 洪永聪 黄志鹏
通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段(可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因).
关键词：
苏云金芽孢杆菌 克隆 蛋白酶 序列分析
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
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