为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出

选取不同浓度的柑橘溃疡病菌SOB培养液,利用载玻片进行固定、封闭、抗体结合、免疫荧光标记及荧光强度检测,以探讨免疫荧光检测技术在柑橘溃疡病菌快速检测方面的应用。结果表明,30℃下用BSA封闭2h,30℃下抗体结合1 h,荧光抗体浓度为4μg/mL,室温放置40 m in后,在荧光显微镜下可以清楚看到绿色的柑橘溃疡病菌体。该方法操作简便,检测过程仅需4 h,抗原抗体反应特异性极强,检测灵敏度可达103cfu/mL。

为培育和筛选李抗病品种提供理论依据 ,对李细菌性黑斑病病菌侵染李的过程和组织病理解剖进行了研究 .结果表明 :病原细菌从伤口、气孔和皮孔侵入李果实、叶片和枝梢 ;病斑深达中果皮数层细胞 ,自果皮向果心可分为 3层 ,第 2层被大量细菌定殖 ,第 3层下缘呈扩散状 ,接近内果皮 ;电镜观察表明病原细菌定殖于细胞间隙 ,使细胞膜和细胞壁离解 ,叶绿体受损 .

将B-298菌株代谢产物与多菌灵、百菌清、大生M-45等3种化学药剂,在室内分别对番茄黑斑病和番茄叶霉病两种病原菌进行抑菌实验。结果表明:不同稀释倍数B-298代谢产物和大生M-45对两种病原菌都有较强的抑菌作用。B-298代谢产物低倍稀释液对番茄黑斑菌的抑制效果与大生M-45抑菌效果相当,抑菌率最高达89.4%,优于百菌清和多菌灵;B-298代谢产物低倍稀释液对番茄叶霉菌的抑制效果,与大生M-45和百菌清相当,抑菌率最高达90.5%,优于多菌灵。

铁皮石斛是一种重要的中草药,随着人工种植面积的扩大和年限延长,铁皮石斛上的各种病害随之而来,其中由链格孢引起的石斛黑斑病日趋严重。本研究选取铁皮石斛黑斑病病原—细极链格孢为供试菌株,采用不同溶剂提取病原小分子毒素,同时对病原小分子毒素的产毒条件进行优化。结果表明,乙酸乙酯的萃取效果最好,且小分子毒素的活性成分主要存在于水相中;当培养基为PSK培养液,温度为25℃,转速为120 r/min,L∶D=12∶12的培养方式全振荡培养7 d时,该病原的小分子毒素活性最强。

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

【目的】明确草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV3′非编码区(non-coding region,NCR)和大外壳蛋白(large coat protein,LCP)基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性...

从江苏句容酥梨黑斑病病叶上分离得到1株对梨黑斑病菌有明显抑制作用的拮抗细菌,代号JR-C,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。胞外酶检测显示:该菌产生蛋白酶和纤维素酶,不产生几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。此外,该菌的代谢产物粗提物可抑制梨黑斑病菌菌丝的正常生长。代谢产物粗提物处理后的梨黑斑病菌菌丝愈发致密、短粗,分支也明显减少。室内测定该菌对梨轮纹病菌、梨腐烂病菌、梨炭疽病菌和稻瘟病菌等多种病原真菌均具有较好的拮抗作用。梨黑斑病主要是叶部病害,而拮抗细菌JR-C菌株从梨树叶片上分离获得,拮抗活性高,拮抗谱广,这为后续利用该菌研制生防菌剂防治梨黑斑病及其他作物病害提供了...

本试验对甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted)进行了生物学特性研究。结果表明:适宜该病原菌生长的碳源为乳糖,氮源为酵母膏,pH 9,菌落直径分别为4.28,3.96,5.10 cm。菌丝在光照、黑暗、光暗交替下均能生长,其中在黑暗条件下生长最好,菌落直径为5.01 cm,菌丝致死温度为55℃、10 min或58℃、5 min。采用菌丝生长速率法进行了4种杀菌剂对甘薯黑斑病菌的毒力测定。结果表明,供试4种杀菌剂对甘薯黑斑病菌菌丝生长均有抑制作用,其中96.3%苯醚甲环唑抑制作用最佳,EC50值为2.52;其次为97%甲基托布津,EC50值为...

【目的】建立苹果黑星病菌(Venturia inaequalis(Cooke)Wint)的分子检测方法,以提高检测精确度,缩短检测时间。【方法】根据苹果黑星病菌与其他苹果病原真菌核糖体基因转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)序列间的差异,设计了1对特异性引物320A/320B,用于苹果黑星病菌的分子检测,对特异性引物扩增条件进行了优化,并验证和检验了引物的特异性和灵敏度。【结果】特异性引物的扩增条带约为320bp,优化的反应体系为:2μL MgCl2(25mmol/L),2.5μL 10×buffer,3μL dNTP(2.5mmol/L),1.2 μL...

通过DNA提取方法对比,采用CTAB/LiCl法提取甘薯黑斑病菌基因组DNA,再利用限制性内切酶BamH I对纯化的甘薯黑斑病菌基因组DNA进行部分酶切,获得大小为15kb左右的DNA片段。将经BamHI酶切消化的Lambda DASH II载体臂与DNA片段相连,然后以大肠杆菌XL1BlueMRA(P2)为寄主细胞,在国内首次成功构建了甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)基因组文库,所构建基因文库效价为4.12×105pfu/mL。

为了明确花生黑斑病菌的致病因子及致病机制，对该病菌分泌的毒素进行了提取和生物学特性测定。通过对花生黑斑病菌毒素产生条件筛选和优化，采用氯仿提取、硫酸铵和柱层析分离纯化病菌产生毒素。结果表明：花生黑斑病菌在Ｖ８培养液、光／暗交替、静止条件下培养２０ ｄ产毒活性最强，用等量的氯仿提取，再经过８０％饱和度的硫酸铵沉淀透析和柱层析纯化，可以获得较高活性的花生黑斑病菌毒素。初步分析显示，毒素由Ａ和Ｂ ２种成分构成，但仅Ａ成分对花生有致病性，Ｂ成分没有，Ａ成分是毒素的主要成分；另外，病菌毒素具有一定的热稳定性和较强的极性。

[目的]柑橘小RNA不仅是黄龙病抗性的调控因子,也可以开发成为黄龙病早期诊断的分子标记。本研究旨在探明小RNA在柑橘黄龙病与寄主互作中的作用。[方法]分别设计并合成了4个小RNA的反转录茎环引物以及相应的表达检测引物;利用实时荧光定量PCR对引物的特异性和扩增效率进行了测试;进一步检测分析了4个小RNA对靶标基因表达的调控情况。[结果]利用本研究设计的引物在健康样品和黄龙病发病样品中均可特异性检测到4个小RNA。相对定量标准曲线斜率表明,4个小RNA引物的扩增效率相近。表达量的相对定量分析表明:4个小RNA的表达与相应靶标基因的表达均呈负相关性; miR-753E-3p、miR-451b、miR2633和miR838-3p在发病样品中的表达量分别为健康对照样品中的4.69、0.44、0.36和3.08倍,而其靶标Cs6g21280、Cs6g05770、Cs2g08190和Cs8g02530在发病样品中的表达量分别为对照的0.14、8.95、3.06和0.29倍。进一步分析表明:这些小RNA的靶标基因在拟南芥中均存在同源基因:Cs6g21280在拟南芥中的同源基因为ATSMC4,与抑制开花和抑制逆境相关的DNA修复有关; Cs6g05770在拟南芥中的同源基因为BAK1,与病原特征分子诱导的抗病反应有关; Cs2g08190在拟南芥中的同源基因为CIPK23,与促进钾离子吸收、扩大叶片的气孔开度有关;Cs8g02530在拟南芥中的同源基因为PIP2,是一个水通道蛋白,可调节植物耐涝耐旱性。[结论]本研究揭示了黄龙病菌与柑橘在小RNA水平上发生的侵染与防卫的对抗作用,为黄龙病病症形成以及寄主免疫相关分子机制的研究提供了新的线索。

比较烟草赤星病菌和黑斑病菌基本生物学特性。结果表明:烟草赤星病菌和黑斑病菌的最适生长温度分别为25～30℃和20～25℃;pH6~9培养条件更有利于烟草赤星病菌的生长;烟草赤星病菌利用葡萄糖和蔗糖的能力明显大于黑斑病菌;两病原菌对硝酸铵、硫酸铵和干酪素的利用情况基本相同,利用能力大小依次为干酪素、硝酸铵、硫酸铵;马铃薯琼脂培养基、葡萄糖琼脂培养基和蔗糖琼脂培养基对两病原菌生长的影响存在显著差异,玉米粉琼脂培养基对两病原菌生长的影响无差异;扑海因和代森锰锌能完全抑制两病原菌的营养生长,百菌清和翠贝对两病原菌的生长抑制作用无明显差异,甲基托布津对赤星病菌的抑制能力强于对黑斑病菌的抑制能力。

用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、苯、石油醚、正己烷8种溶剂对库拉索芦荟的抗菌活性物质进行提取,提取产率随溶剂极性的增强而提高。以白菜黑斑病菌为测试菌,用生长速率法测定芦荟各种溶剂粗提物的抑菌活性,当提取物浓度为10mg/mL时,各种溶剂粗提物均表现一定的抑菌效果,其中以石油醚、正己烷和乙酸乙酯的粗提物抑菌效果最好,分别为71.4%、71.3%和62.4%。从抑菌效果及提取产率两方面考虑,乙酸乙酯为提取芦荟抑菌活性物质的最佳溶剂。通过测定甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯4种溶剂1%~10%系列浓度对白菜黑斑病菌的抑制作用及甲醇、丙酮、乙酸乙酯3种溶剂对各种芦荟粗提物的溶解性,确立用乙酸乙酯-水(7...