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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
邓杰夫 李魏 雷玲 洪艳云 刘双清 戴良英 易图永
为进一步了解柑橘黄龙病菌亚洲种Clas的致病机理，从Prasad预测的166种分泌蛋白中选取1个在柑橘植株中表达量较高的CLIBASIA–04580基因进行研究。提取感染柑橘黄龙病的柑橘叶片总DNA，经 PCR扩增得到 CLIBASIA–04580基因，切胶回收PCR产物双酶切连接到pET–28a载体上，使用菌落PCR和限制性内切酶双酶切鉴定筛选阳性克隆；转化大肠杆菌 BL21(DE3)，使用0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导重组蛋白表达融合组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白，聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS–PAGE)检测重组蛋白的表达水平，然后使用蛋白纯化镍柱进行纯化。结果表明，携带组氨酸标签的CLIBASIA–04580重组蛋白得到表达，且异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度为1.5 mmol/L时相对表达量达到峰值，通过SDS–PAGE凝胶分析，与未经过镍柱纯化的蛋白原液比较可知成功纯化了CLIBASIA–04580重组蛋白。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王春庆 钟八莲 卢占军 黄爱军 陈慈相 苏华楠
柑橘黄龙病是我国柑橘产业可持续发展面临的重大威胁,建立高效、准确、灵敏的检测方法是黄龙病防控的关键.通过生物信息学分析柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)不同菌株基因组,预测出83个经典分泌蛋白和87个非经典分泌蛋白.选定其中14个分泌蛋白基因,经大肠杆菌密码子优化后构建pET-28a-CLasSec和pCold-I-CLasSec系列原核表达载体.经IPTG诱导条件优化、镍磁珠法纯化后,获得了CLasSec2、CLasSec4、CLasSec5、CLasSec6、CLasSec8和CLasSec12等6个柑橘黄龙病菌亚洲种分泌蛋白.
关键词：
柑橘黄龙病 分泌蛋白 效应子 原核表达
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
王文婷 张晨燕 赵可冉 丁建华 荆恩荣 杨超
【目的】双组分系统VfmH/VfmI与Dickeya属病原菌的致病因子和致病过程有关。研究D fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化，为明确VfmH/VfmI的调控机理提供依据。【方法】采用RT-PCR方法扩增D. fangzhongdai Onc5菌株，获取vfmH和vfmI基因开放阅读框（ORF）。随后将目的基因克隆至原核表达质粒pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VfmH和pET-32a-VfmI，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白，并利用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。【结果】D. fangzhongdai Onc5菌株vfmH和vfmI的ORF大小分别为1 401 bp和1 320 bp，分别编码466个和439个氨基酸；同源性分析表明，其氨基酸序列与Dickeya属其他菌种的vfmH和vfmI序列具有很高的相似性；SDS-PAGE和Western blot鉴定分析表明：添加0.5 mmol·L-1 IPTG，可诱导重组质粒pET-32a-VfmH转化株和pET-32a-VfmI转化株表达产生大量携带His-tag的融合重组蛋白；同时，成功纯化出目的蛋白。【结论】本研究首次克隆出D. fangzhongdai中双组分系统基因vfmH和vfmI，并成功纯化出VfmH和VfmI蛋白。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王玉卿 赵继新 庞玉辉 降彦苗 陈新宏 武军 刘淑会
【目的】克隆华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因:Gli-Ns-2(FJ713595)、Gli-Ns-3(GQ139525)、Gli-Ns-4(GQ1...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
袁志栋 王志亮 刘雨田 吴晓东 赵永刚 刘海生
目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活...
关键词：
水牛成熟PrP 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
申建梅 胡黎明 宾淑英 廖泓之 林进添
利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae(Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP。测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨基酸。氨基酸序列比对及三维结构同源建模表明,此序列具有OBPs的典型特征,序列中具有6个保守的半胱氨酸和6个α螺旋区域。构建了重组表达载体pET28a(+)-BcucOBP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,在IPTG进...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
李晓梅 陈永 李珣 钟国华
利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与已知真核生物泛素延伸蛋白的同源性为92%～98%。RT-PCR结果显示Px-ubi在小菜蛾不同生长发育时期均有表达,其中卵期、3龄期和预蛹期含量较高,而成虫期含量较低。同源建模显示,Px-ubi的3D结构主要由1个α螺旋、4个β折叠以及β转角和不规则卷曲组成,4个β折叠两两反向平...
关键词：
小菜蛾 泛素 基因 克隆 原核表达
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
秦平伟 段明革 孙文婷 李名扬 徐晶
金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试...
关键词：
金属硫蛋白 克隆 序列分析 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
张崇文 于涟 毛芝娟 褚武英 钱荣华
根据哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从分离自患病大黄鱼的哈维氏弧菌基因组中扩增获得一段约800bp的序列。将其克隆到pGEMTeasy载体,测序结果证明该序列是哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK基因。用PCR方法去除其信号肽序列,定向克隆到原核表达载体pGEX4T2构建重组表达质粒pGEX4TOmpK。IPTG诱导后能够在大肠杆菌BL21中高效表达分子量约为53kD的GSTOmpK融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫新西兰兔获得了高效价的抗血清。Westernblotting分析表明,它与从哈维氏弧菌中提取的约27kD的外膜蛋白能够发生特异反应,提示外膜...
关键词：
哈维氏弧菌 外膜蛋白 OmpK 原核表达
[期刊] 水产学报
[作者]
梁海鹰 夏立群 吴灶和 简纪常 鲁义善
参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗...
[期刊] 水产学报
[作者]
梁银龙 曹敏杰 郭川 苏文金 张凌晶 刘光明
通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 ku的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
陈春琳 刘祥 俱雄
【目的】构建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表达载体,优化OmpK蛋白的诱导表达条件,制备OmpK蛋白小鼠多克隆抗体。【方法】通过PCR扩增获得ompK基因,连接pET-32a质粒构建OmpK-pET32a载体,将其转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达。利用切胶纯化获得OmpK蛋白后,免疫小鼠制备OmpK蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western-Blotting法检测抗血清特异性。通过正交试验,获得OmpK菌株的最佳诱导表达条件与培养条件。【结果】PCR扩增获得了长816bp的ompK基因;成功构建了OmpK-pET32a载体,其诱导表达产物分子质量为30ku,与预期结果一致。E...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王慈 曹敏杰 郑晓江 詹春兰 刘光明 蔡秋凤
以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉cDNA为模板,利用小清蛋白特异性引物进行PCR扩增,克隆得到β小清蛋白两种不同亚型,即Ⅰ型、Ⅱ型编码区基因。将目的基因片段连接到pET28a(+)表达载体,并在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中诱导表达。结果表明,经诱导的小清蛋白重组质粒菌株有特异的蛋白表达。SDS-PAGE分析显示,目的蛋白的分子量约为13 kD,与预期大小一致。菌体超声破碎后发现2种亚型的小清蛋白均为可溶表达。利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,得到高纯度的重组小清蛋白PVⅠ和PVⅡ。经Western Blot鉴定,重组小清蛋白PVⅠ和P...
关键词：
鲢 小清蛋白 cDNA克隆 原核表达
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