为使一种柑橘黄龙病碘—淀粉法快速检测技术更好地应用于大田检测,以砂糖橘为试验材料,研究无需冷冻和缩短叶片脱色时间的技术.结果表明,磨掉叶片正反面表面蜡质层后,直接脱色,可以省去冷冻处理步骤,且不影响检测结果;检测结果与常规PCR检出结果的一致率为92.5%;同时,叶片脱色时间缩短7.178.47 h.优化后,冬季样品叶绿素脱除所需时间均值为5.0 h,其他季节叶片脱色时间均值为3.7 h.

针对近年湘南部分柑橘产区出现叶片黄化、果实畸形及全株矮化、橘树枯死等柑橘黄龙病疑似症状,应用多聚酶链式反应(PCR)技术对湘南8个柑橘产区的柑橘进行了检测,结果发现6个柑橘产区有柑橘黄龙病为害.同时建立了一套快速、准确的柑橘黄龙病PCR检测技术体系.

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察,结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形,极少观察到棒状形态,直径为100~500 nm,外被一层胶状物质包围,厚约10~50 nm,这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同.PCR检测表明,以硅藻土法提取的DNA为模板,利用Ready-To-GoTM PCR bead法可以得到理想结果.

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

柑橘植物组织中富含多糖、酚类、单宁、色素等物质,它们的存在严重干扰了柑橘黄龙病PCR检测的准确性。因此有必要筛选出一种能得到纯度高、结构完整的柑橘总DNA(含黄龙病病原DNA),且操作简便的提取方法。本研究对比试验了3种柑橘总DNA提取方法,方法1采用Sandrine等人的提取法;方法2采用CTAB法;方法3采用试剂盒法。实验研究表明,方法2提取柑橘黄龙病病原DNA的PCR检测准确率最高。

【目的】黄龙病（Huanglongbing,HLB）是一种毁灭性柑橘病害，主要由韧皮部杆菌属亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染引起。本研究旨在探究侵染初期CLas在柑橘毛状根中的增长规律，优化发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的黄龙病抗性快速评价体系并应用于抗菌肽的抗性评价。【方法】基于植物表达载体pGNGM1300，通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化体系转化不同柑橘品种，筛选毛状根诱导快、转化率高的品种；接种CLas后，利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)对毛状根中的CLas进行定期检测，揭示其增长规律；在优化黄龙病抗性评价体系的基础上，通过CLas和相关基因的（RT-）qPCR、胼胝质含量检测、显微结构观察和症状观察等开展抗菌肽的黄龙病抗性评价。【结果】供试的11个柑橘品种中，香橼（Citrus medica）的毛状根诱导最快（15 d）、诱导率最高（73.75%），并且毛状根中转基因阳性率高（53.54%）。qPCR定期监测结果显示，在接种后第20—30天（days post inoculation,dpi）,CLas开始在根中定殖；在30—50 dpi,CLas含量呈显著上升的趋势；CLas含量在60—120 dpi时略有波动，但与50 dpi时差异不显著。抗菌肽MaSAMP(stable antimicrobial peptide)、HBD-4(homo sapiens defensin beta 4)和CB(cecropin B)的抗性评价结果分析显示，在50—120 dpi,MaSAMP和CB表达植株中CLas含量均低于对照，且差异显著，除90 dpi外HBD-4表达植株中CLas含量也显著低于对照。3种抗菌肽表达植株中的胼胝质含量均显著低于对照（60 dpi），韧皮部细胞壁增厚不明显，未出现明显的淀粉粒和胼胝体沉积，并且均未发现根部死亡等现象（90 dpi）。【结论】揭示了侵染早期CLas在柑橘毛状根中的增长规律；优化了发根农杆菌介导的黄龙病抗性快速评价体系；明确转基因过表达抗菌肽MaSAMP、HBD-4和CB可显著抑制CLas的增殖，减少胼胝质沉积，减轻黄龙病症状，具有用于黄龙病防控实践的潜力。

[目的]柑橘小RNA不仅是黄龙病抗性的调控因子,也可以开发成为黄龙病早期诊断的分子标记。本研究旨在探明小RNA在柑橘黄龙病与寄主互作中的作用。[方法]分别设计并合成了4个小RNA的反转录茎环引物以及相应的表达检测引物;利用实时荧光定量PCR对引物的特异性和扩增效率进行了测试;进一步检测分析了4个小RNA对靶标基因表达的调控情况。[结果]利用本研究设计的引物在健康样品和黄龙病发病样品中均可特异性检测到4个小RNA。相对定量标准曲线斜率表明,4个小RNA引物的扩增效率相近。表达量的相对定量分析表明:4个小RNA的表达与相应靶标基因的表达均呈负相关性; miR-753E-3p、miR-451b、miR2633和miR838-3p在发病样品中的表达量分别为健康对照样品中的4.69、0.44、0.36和3.08倍,而其靶标Cs6g21280、Cs6g05770、Cs2g08190和Cs8g02530在发病样品中的表达量分别为对照的0.14、8.95、3.06和0.29倍。进一步分析表明:这些小RNA的靶标基因在拟南芥中均存在同源基因:Cs6g21280在拟南芥中的同源基因为ATSMC4,与抑制开花和抑制逆境相关的DNA修复有关; Cs6g05770在拟南芥中的同源基因为BAK1,与病原特征分子诱导的抗病反应有关; Cs2g08190在拟南芥中的同源基因为CIPK23,与促进钾离子吸收、扩大叶片的气孔开度有关;Cs8g02530在拟南芥中的同源基因为PIP2,是一个水通道蛋白,可调节植物耐涝耐旱性。[结论]本研究揭示了黄龙病菌与柑橘在小RNA水平上发生的侵染与防卫的对抗作用,为黄龙病病症形成以及寄主免疫相关分子机制的研究提供了新的线索。

【目的】利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条,建立一种快速简便、特异、灵敏、裸眼可视的柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)检测新方法。【方法】根据CYVCV外壳蛋白基因的保守序列设计5对引物,通过样品检测筛选出扩增效果好、特异性强的引物对。将选出的引物进行标记物修饰,并设计对应的特异性探针,分别设置6个反应时间梯度(5、10、20、30、40、50 min)和8个反应温度梯度(37、38、39、40、41、42、43、44℃),对RT-RPA反应条件进行优化,建立CYVCV的RT-RPA检测体系。分别以仅感染了CYVCV、柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)和柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)柑橘材料的总核酸为模板,采用所筛选的最佳引物、探针和反应条件进行检测,评价所建立RT-RPA检测体系的特异性。将感染了CYVCV的柑橘总RNA样品进行10倍梯度稀释,以原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)稀释液作为模板,平行进行RT-PCR及RT-RPA的检测,评价所建立检测方法的灵敏度。随机采集来自田间9个不同品种柑橘的叶片,同时进行RT-RPA和RT-PCR检测,检验所建立RT-RPA检测方法的适用性。【结果】建立了CYVCV的RT-RPA检测体系:最佳引物为CY1-F/R,对应探针为CY1-Probe(47 bp),最佳反应条件为39℃,30 min,特异扩增目的片段为177 bp,检测结果可通过侧向流层析试纸条直接判读。特异性检测结果显示,利用该检测体系仅对感染了CYVCV的样品检测结果为阳性,其余均为阴性;灵敏度检测结果显示,RT-RPA与RT-PCR方法均最低可检测到10~(-4)稀释液,两种方法检测灵敏度相当。随机采集的45株田间柑橘样品中,RT-PCR与RT-RPA均检测出37个阳性样品,检出率均为82.2%,表明该方法检测效果稳定可靠。【结论】建立了CYVCV的RT-RPA检测方法,该检测方法操作简单、反应快速,结果裸眼可视,适用于基层条件不足的实验室或者植检站现场快速检测。

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种无法根治且易扩散的病害,建立柑橘黄龙病病情诊断及分类的方法,以及时发现并去除病株,防止感染其他果树。【方法】基于高光谱成像技术,利用最小噪声分离变换进行降维去噪、像元纯净指数获取纯净像元并建立训练集,通过Fisher判别法对柑橘黄龙病病情进行鉴别并分类。【结果】通过对训练集设置适当的门限值,柑橘黄龙病病情识别正确率达90%以上。【结论】利用高光谱技术进行柑橘黄龙病病情诊断具有较高的可行性。

采用激光诱导击穿光谱(LIBS)结合化学计量学的方法对柑橘叶片黄龙病进行定性检测。试验结果显示:柑橘叶片中营养元素P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的LIBS信号强度与柑橘叶片的健康程度有直接关系,其中健康、中度感染黄龙病和重度感染黄龙病的柑橘叶片中P(Ⅱ)、Mn(Ⅰ)、Si(Ⅰ)和Fe(Ⅰ)的特征光谱强度呈依次减少的关系;然后再分别建立5个特征光谱以及采用光谱融合方法将5个特征光谱融合的偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)模型,并对其判别模型进行分析,其中Fe(Ⅰ)的RMSEC为0.394,R_c为0.871,总误判率为23.1%;RMSEP为0.454,R_p为0.841,总误判率为26.6%。光谱融合的RMSEC为0.341,R_c为0.905,总误判率为15.5%,RMSEP为0.395,R_p为0.867,总误判率为22.7%;利用归一化、多元散射校正(MSC)、标准正态变换(SNV)和正交信号校正(OSC)4种预处理方法对原始光谱进行预处理,并建立PLS-DA模型。研究结果表明,利用LIBS技术结合OSC光谱预处理和PLS-DA建模方法,模型的RMSEC为0.027,R_c为0.994,总误判率为0;RMSEP为0.023,R_p为0.995,总误判率为0,对3种类别的柑橘叶片能进行较好地分类。

【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法...

【目的】探寻一种快速、简便、灵敏而可靠的检测植物组织和单头蚜虫中柑橘衰退病毒的方法。【方法】运用反转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription nested polymerase chain reaction,RT-nested-PCR)、印记捕获反转录巢式多聚酶链式反应(print capture reverse transcription nested polymerase chain reaction,PC-RT-nested-PCR...

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出

【目的】对柑橘健康植株和感染黄龙病植株的韧皮部内生细菌的多样性进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rDNA基因的限制性酶切长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得10个属细菌类群,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)为无症健株的优势菌群;微杆菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、假单...

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘Ca.L.asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-...