柑橘植物组织中富含多糖、酚类、单宁、色素等物质,它们的存在严重干扰了柑橘黄龙病PCR检测的准确性。因此有必要筛选出一种能得到纯度高、结构完整的柑橘总DNA(含黄龙病病原DNA),且操作简便的提取方法。本研究对比试验了3种柑橘总DNA提取方法,方法1采用Sandrine等人的提取法;方法2采用CTAB法;方法3采用试剂盒法。实验研究表明,方法2提取柑橘黄龙病病原DNA的PCR检测准确率最高。

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察,结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形,极少观察到棒状形态,直径为100~500 nm,外被一层胶状物质包围,厚约10~50 nm,这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同.PCR检测表明,以硅藻土法提取的DNA为模板,利用Ready-To-GoTM PCR bead法可以得到理想结果.

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘Ca.L.asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-...

针对近年湘南部分柑橘产区出现叶片黄化、果实畸形及全株矮化、橘树枯死等柑橘黄龙病疑似症状,应用多聚酶链式反应(PCR)技术对湘南8个柑橘产区的柑橘进行了检测,结果发现6个柑橘产区有柑橘黄龙病为害.同时建立了一套快速、准确的柑橘黄龙病PCR检测技术体系.

为使一种柑橘黄龙病碘—淀粉法快速检测技术更好地应用于大田检测,以砂糖橘为试验材料,研究无需冷冻和缩短叶片脱色时间的技术.结果表明,磨掉叶片正反面表面蜡质层后,直接脱色,可以省去冷冻处理步骤,且不影响检测结果;检测结果与常规PCR检出结果的一致率为92.5%;同时,叶片脱色时间缩短7.178.47 h.优化后,冬季样品叶绿素脱除所需时间均值为5.0 h,其他季节叶片脱色时间均值为3.7 h.

【目的】探究基于无人机可见光通道和支持向量机（SVM）模型的柑橘黄龙病个体识别方法，为生产上快速、高效发现柑橘黄龙病病株提供参考依据。【方法】构建2套基于SVM的识别模型，先通过柑橘黄龙病黄化识别模型确定具备黄龙病黄化特征的植株，再通过黄龙病斑驳特征识别模型对黄化植株的叶片进行斑驳特征分析确认黄龙病植株；对模型进行1次个体识别试验和2次普适性验证试验。【结果】对于黄龙病植株黄化特征识别，红（R）、绿（G）、蓝（B）、色调（H）和明度（V）在光谱分布上均具备特征性，可作为柑橘黄龙病黄化识别模型的输入变量；对于黄龙病叶片斑驳特征识别，通过叶片左、右部分平均反射率之差（D_(rl)）和上、下部分平均反射率之差（D_(ub)）及波形振幅的平均值（■）可有效排除缺素及其他非黄龙病黄化病害对识别结果的干扰，上述3个指标可作为柑橘黄龙病斑驳特征识别模型的输入变量。在个体识别试验中，对28株柑橘进行基于无人机可见光通道和SVM模型的柑橘黄龙病个体识别，识别准确率达100.00%。在中国南方柑橘黄龙病防治研究中心果场开展的普适性验证试验中，对4383株柑橘进行识别，非黄龙病个体识别准确率达100.00%，黄龙病个体识别准确率为89.47%；在广西南宁市武鸣区四明村果园开展的普适性试验中，非黄龙病个体识别准确率为97.30%，黄龙病个体识别准确率为86.67%。【结论】基于无人机可见光通道和SVM机模型的柑橘黄龙病个体识别方法能较好地识别柑橘种植区的黄龙病植株，且相较于高光谱识别方法成本更低，可在柑橘种植区域黄龙病防治中广泛应用。

【目的】柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是一种无法根治且易扩散的病害,建立柑橘黄龙病病情诊断及分类的方法,以及时发现并去除病株,防止感染其他果树。【方法】基于高光谱成像技术,利用最小噪声分离变换进行降维去噪、像元纯净指数获取纯净像元并建立训练集,通过Fisher判别法对柑橘黄龙病病情进行鉴别并分类。【结果】通过对训练集设置适当的门限值,柑橘黄龙病病情识别正确率达90%以上。【结论】利用高光谱技术进行柑橘黄龙病病情诊断具有较高的可行性。

【目的】克隆柑橘黄龙病病原菌非洲种和美洲种23S-5S rDNA序列并和亚洲种相应区域进行比对,阐明黄龙病3个种核糖体RNA操纵子之间的关系。【方法】根据亚洲种23S-5S rRNA基因区域序列的保守性设计引物,在非洲种和美洲种DNA样品上扩增,对PCR产物进行克隆和测序,并对新获得的序列进行序列验证和分析。【结果】非洲种获得了3 057 bp序列包括23S rRNA基因、细胞壁脱氢酶假基因和5S rRNA基因;美洲种获得了3 033 bp序列包括23S rRNA基因、glpK基因和5S rRNA基因。3个种核糖体基因顺序分别是:亚洲种16S rRNA、tRNAIle、tRNAAla、23S ...

【目的】对柑橘健康植株和感染黄龙病植株的韧皮部内生细菌的多样性进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。【方法】采用常规分离培养与分子鉴定的方法和基于16S rDNA基因的限制性酶切长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析的方法。【结果】用常规分离与分子鉴定方法获得10个属细菌类群,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)为无症健株的优势菌群;微杆菌属(Microbacterium sp.)、芽孢杆菌属、假单...

【目的】评价土霉素(oxytetracycline,OTC)药剂对不同发病程度柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)的防治效果,并检测OTC处理后韧皮部关键基因——韧皮部蛋白2(PP2)的表达量变化,为HLB的有效防控提供科学依据,也为OTC作用机理研究提供参考。【方法】应用可有效抑制、杀死病原菌的OTC,树干定量注射0.1 g/树于不同发病程度HLB(初感染、轻度发病和重度发病3组)的4年生Valencia夏橙,注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia叶片样品监测HLB致病菌Cadidatus Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表达量变化。树干注射OTC后90 d采集不同处理Valencia的嫩叶、成熟叶片及茎,进行淀粉染色光学显微观察(LM),直观反映植株累积淀粉的变化。树干注射OTC后80 d调查柑橘嫩叶抽发的情况,综合一系列指标评价OTC对HLB的防治效果。【结果】注射OTC 0.1 g/树对初感染HLB的4年生Valencia植株治疗作用最明显,7 d后检测即为阴性,并可保持90 d,其成熟叶片的淀粉含量明显减少,但茎内仍有淀粉粒富集;轻度发病夏橙注射90 d后叶片内的Las含量从(1.68×10~6±858884)cells/g叶片减至(7.21×10~4±30981)cells/g叶片,下降幅度极为明显,其成熟叶片内的淀粉含量在90 d内一直呈下降趋势;重度发病植株注射后叶片内的Las含量从(4.10×108±3.04×10~8)cells/g叶片减至(2.80×10~7±2.70×10~7)cells/g叶片,但从数量而言仍然有较多分布,除了新长出的秋梢,其成熟叶及茎内的淀粉粒含量仍旧很大,说明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度发病Valencia夏橙。对PP2基因表达分析结果显示,注射OTC后30 d,Valencia夏橙体内的PP2基因表达量大幅度下降,随后90 d内表达量稳定,与注射后30 d的表达量较为一致。【结论】OTC可以用于HLB的防控,对初感染(Las含量为9.00×10~7 cells/g叶片)的治疗。注射OTC后,PP2基因表达量下降明显,说明OTC可有效减少韧皮部病菌等的胁迫压力。

【目的】黄龙病（Huanglongbing,HLB）是一种毁灭性柑橘病害，主要由韧皮部杆菌属亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）侵染引起。本研究旨在探究侵染初期CLas在柑橘毛状根中的增长规律，优化发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的黄龙病抗性快速评价体系并应用于抗菌肽的抗性评价。【方法】基于植物表达载体pGNGM1300，通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化体系转化不同柑橘品种，筛选毛状根诱导快、转化率高的品种；接种CLas后，利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)对毛状根中的CLas进行定期检测，揭示其增长规律；在优化黄龙病抗性评价体系的基础上，通过CLas和相关基因的（RT-）qPCR、胼胝质含量检测、显微结构观察和症状观察等开展抗菌肽的黄龙病抗性评价。【结果】供试的11个柑橘品种中，香橼（Citrus medica）的毛状根诱导最快（15 d）、诱导率最高（73.75%），并且毛状根中转基因阳性率高（53.54%）。qPCR定期监测结果显示，在接种后第20—30天（days post inoculation,dpi）,CLas开始在根中定殖；在30—50 dpi,CLas含量呈显著上升的趋势；CLas含量在60—120 dpi时略有波动，但与50 dpi时差异不显著。抗菌肽MaSAMP(stable antimicrobial peptide)、HBD-4(homo sapiens defensin beta 4)和CB(cecropin B)的抗性评价结果分析显示，在50—120 dpi,MaSAMP和CB表达植株中CLas含量均低于对照，且差异显著，除90 dpi外HBD-4表达植株中CLas含量也显著低于对照。3种抗菌肽表达植株中的胼胝质含量均显著低于对照（60 dpi），韧皮部细胞壁增厚不明显，未出现明显的淀粉粒和胼胝体沉积，并且均未发现根部死亡等现象（90 dpi）。【结论】揭示了侵染早期CLas在柑橘毛状根中的增长规律；优化了发根农杆菌介导的黄龙病抗性快速评价体系；明确转基因过表达抗菌肽MaSAMP、HBD-4和CB可显著抑制CLas的增殖，减少胼胝质沉积，减轻黄龙病症状，具有用于黄龙病防控实践的潜力。

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。

柑橘黄龙病是我国柑橘产业可持续发展面临的重大威胁,建立高效、准确、灵敏的检测方法是黄龙病防控的关键.通过生物信息学分析柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)不同菌株基因组,预测出83个经典分泌蛋白和87个非经典分泌蛋白.选定其中14个分泌蛋白基因,经大肠杆菌密码子优化后构建pET-28a-CLasSec和pCold-I-CLasSec系列原核表达载体.经IPTG诱导条件优化、镍磁珠法纯化后,获得了CLasSec2、CLasSec4、CLasSec5、CLasSec6、CLasSec8和CLasSec12等6个柑橘黄龙病菌亚洲种分泌蛋白.

【目的】研究甜橙(Citrus sinensis)在柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测...

【目的】全面了解柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,简称HLB)在福建省的危害分布及其流行情况,有效指导HLB的防控。【方法】对全省48个县(市、区)及245个柑橘主产乡镇HLB虫媒柑橘木虱(Diaphorina citri)分布及HLB的危害进行调查,以PCR(polymerase chain reaction,PCR)方法对采集的斑驳黄化柑橘叶片、红鼻果进行确证性检测,分析HLB的危害流行规律,并应用滑动相关分析筛选影响HLB流行的气象要素。【结果】全省各县及柑橘主产乡镇均可查到柑橘木虱和HLB病株(最北N28°07′、海拔最高880m),HLB危害程度为平均发病率16....