【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法...

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104....

【目的】建立一种快速、灵敏的逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)检测寄主植物和传毒介体体内的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)。【方法】合成4条针对RBSDV S10核苷酸序列6个位点的特异性引物。分别对引物浓度、MgSO4浓度、反应温度和时间进行优化。将感病水稻总RNA梯度稀释后进行灵敏性检验并与RT-PCR比较分析。选择RBSDV和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)验证该方法的特异性。用本RT-LAMP方法检测田间病株。【结果】RT-LAMP检测方法可排除SRBSDV的干扰而特异地检测植物和飞虱体内的RBSDV,与RT-P...

【目的】甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)侵染甘薯造成重要危害,本研究旨在利用反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立一种快速、高效检测SPFMV的方法。【方法】从Gen Bank上获得SPFMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因的核苷酸序列,利用Primer Explorer V4设计4条RT-LAM

【目的】葡萄Ａ病毒（ＧｒＡｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ，ＧｖＡ）是葡萄皱木复合病的重要病原之一，以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径。使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施，而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证。为此，开展针对ＧｖＡ的反转录环介导等温扩增技术（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒＡｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉＡｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍＡｌ ＡｍｐｌｉｆｉｃＡｔｉｏｎ，ｒｔ－ｌＡｍｐ）研究，旨在建立其ｒｔ－ｌＡｍｐ特异性检测方法。【方法】通过比对分析ＧｖＡ的ｃｐ（ｃｏＡｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）基因序列并经引物设计软件ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｌｏｒｅ ４．０设计，获得６条检测．．．

【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTG...

【目的】基于逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(West African,WA)的可视化检测方法。【方法】针对SPCSV西非株系(SPCSV-WA)的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板,进行一步法RT-LAMP,在65℃条件下反应1 h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果,同时对扩...

【目的】建立一种利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的方法。【方法】在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物,每组引物包括一对外引物(F3/B3)和一对内引物(FIP/BIP),从3组引物中筛选出一组效果最好的引物。对RT-LAMP反应体系,即Mg~(2+)、d NTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化,Mg~(2+)浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L~(-1),Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L~(-1),FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol·L~(-1),F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4μmol·L~(-1);优化RT-LAMP反应条件,采用已优化的反应体系,设置65、63、61、59、57℃5个不同的反应温度,反应时间设定为90 min。在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中,使用荧光定量PCR仪,在反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号积累实时监测整个反应过程,根据扩增曲线判断反应结果。以携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,Ap MV)的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性。将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释,以RNA原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)稀释液作为模板,进行RT-LAMP反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。随机采集23株苹果树的叶片,同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测。【结果】建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的检测体系为:6.0 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、1.2 mmol·L~(-1) d NTPs、0.2 mol·L~(-1) Betaine、1.6μmol·L~(-1) FIP/BIP和0.2μmol·L~(-1) F3/B3引物,最佳反应条件为59℃,60 min。特异性检测中,仅ACLSV检测结果为阳性,对照组均为阴性。灵敏性检测中,RT-LAMP方法最低可检测到10-3 RNA稀释液,灵敏度是RT-PCR方法的100倍。随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2%,RT-LAMP阳性检出率为65.2%,RT-LAMP的检出率高于RT-PCR。【结论】建立的ACLSV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏性高、成本低等特点,可满足基层、科研部门在田间调查、种苗繁育和海关检疫中快速检测ACLSV。

【目的】利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术(reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA),结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条,建立一种快速简便、特异、灵敏、裸眼可视的柑橘黄化脉明病毒(citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)检测新方法。【方法】根据CYVCV外壳蛋白基因的保守序列设计5对引物,通过样品检测筛选出扩增效果好、特异性强的引物对。将选出的引物进行标记物修饰,并设计对应的特异性探针,分别设置6个反应时间梯度(5、10、20、30、40、50 min)和8个反应温度梯度(37、38、39、40、41、42、43、44℃),对RT-RPA反应条件进行优化,建立CYVCV的RT-RPA检测体系。分别以仅感染了CYVCV、柑橘叶斑驳病毒(citrus leaf blotch virus,CLBV)、柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)、柑橘碎叶病毒(citrus tatter leaf virus,CTLV)、柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘鳞皮病毒(citrus psorosis virus,CPV)、温州蜜柑萎缩病毒(satsuma dwarf virus,SDV)、柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)和柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)柑橘材料的总核酸为模板,采用所筛选的最佳引物、探针和反应条件进行检测,评价所建立RT-RPA检测体系的特异性。将感染了CYVCV的柑橘总RNA样品进行10倍梯度稀释,以原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)、10~(-7)稀释液作为模板,平行进行RT-PCR及RT-RPA的检测,评价所建立检测方法的灵敏度。随机采集来自田间9个不同品种柑橘的叶片,同时进行RT-RPA和RT-PCR检测,检验所建立RT-RPA检测方法的适用性。【结果】建立了CYVCV的RT-RPA检测体系:最佳引物为CY1-F/R,对应探针为CY1-Probe(47 bp),最佳反应条件为39℃,30 min,特异扩增目的片段为177 bp,检测结果可通过侧向流层析试纸条直接判读。特异性检测结果显示,利用该检测体系仅对感染了CYVCV的样品检测结果为阳性,其余均为阴性;灵敏度检测结果显示,RT-RPA与RT-PCR方法均最低可检测到10~(-4)稀释液,两种方法检测灵敏度相当。随机采集的45株田间柑橘样品中,RT-PCR与RT-RPA均检测出37个阳性样品,检出率均为82.2%,表明该方法检测效果稳定可靠。【结论】建立了CYVCV的RT-RPA检测方法,该检测方法操作简单、反应快速,结果裸眼可视,适用于基层条件不足的实验室或者植检站现场快速检测。

【目的】探寻一种快速、简便、灵敏而可靠的检测植物组织和单头蚜虫中柑橘衰退病毒的方法。【方法】运用反转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription nested polymerase chain reaction,RT-nested-PCR)、印记捕获反转录巢式多聚酶链式反应(print capture reverse transcription nested polymerase chain reaction,PC-RT-nested-PCR...

将逆转录环介导的等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)引入到鱼类的传染性造血器官坏死病病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)检测中,建立了简单、快速、灵敏的IHNV检测方法。针对IHNV的聚合酶蛋白基因(polymerase protein,L)设计特异性引物,以IHNV基因组RNA为模板,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下进行RT-LAMP,反应产物添加SYBR Green I荧光染料后,肉眼观察阳性样本表现为荧光...

【目的】建立一种适用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的快速、灵敏、特异性检测方法,即一步反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)。【方法】设计3对针对PRRSVN基因的8个位点的特异性引物,用优化后的反应体系检测RT-LAMP的特异性、灵敏性并对临床样本进行检测。【结果】RT-LAMP检测方法从核酸抽提到检测仅需要70min,肉眼即可观察检测结果,该方法具有良好的特异性,灵敏度是RT-PCR的10000倍,在对50份猪血液样本RNA的检测中,该方法与传统的RT-PCR检测方法具有很好的统一性(κ=0.83)。【结论】RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测。

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱...

哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起海南省后水湾深水网箱养殖卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)"烂身病"的主要病原菌。为了能够快速诊断该病原菌,急需建立一种耗时短、准确以及便捷的检测方法。本研究利用分离到的致病菌株QT520的ToxR基因序列设计特异性引物和加入SYTO-9特异荧光染料,建立了一种可以实时、快速检测哈维氏弧菌的LAMP法(RT-LAMP)。该方法对哈维氏弧菌的基因组DNA及菌液灵敏度分别为100 fg/μL和10~3 cfu/mL,与Real-time PCR法检测灵敏度相当,比普通PCR的检测灵敏度要分别高1000倍和10倍,能有效区分哈维氏弧菌与坎氏弧菌(Vibrio campbellii);可以实时观察检测结果,且检测时间只需要40 min;具有耗时短、特异性和灵敏度高、仪器便携、操作简单且能实时观察检测结果等优点,非常适合在生产现场进行哈维氏弧菌的检测。

为提高草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)的检测效率,根据GCRV-873株VP5基因片段,设计了2对特异性引物,建立了检测GCRV-873株的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。结果显示:该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,比传统的RT-PCR方法要高10倍。且不与鲤春病毒、传染性造血器官坏死病病毒、传染性胰脏坏死病毒和病毒性出血性败血症病毒RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见,是一种特异性强、方便快捷的检测方法,适合GCRV-873株的现场初筛和核酸检测工作。