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[期刊] 中国农业科学
[作者]
李芳 邓子牛 赵亚 李大志 戴素明
【目的】构建柑橘衰退病毒（Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ，Ｃｔｖ）含ｐ２３的ｒＮａｉ载体，以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性，根据ＮＣＢｉ公布的Ｃｔｖ基因组序列，查找ｐ２３保守序列，设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体ｐ Ｂｉ １２１进行双酶切和连接来构建ｒＮａｉ载体。初步预测所构建的载体发生ｒＮａｉ抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含ｒＮａｉ载体的农杆菌注射入Ｃｔｖ指示植物墨西哥莱蒙的叶片，利用Ｇｕｓ组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种Ｃｔｖ ｔ３６基因型，利用酶联免疫反应（ｅＬｉｓａ）．．．
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李芳 邓子牛 赵亚 李大志 戴素明
基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用No
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张凌云 贝学军 钟广炎
用RT–PCR克隆柑橘的CsERF1基因cDNA序列,并连接到TA克隆载体pMD–19T上;经限制性内切酶2次双酶切,CsERF1基因的正、反向片段被分别插入到双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了CsERF1基因的RNA干涉载体;通过农杆菌介导法转化柑橘,已获得部分抗性芽。
[期刊] 华北农学报
[作者]
田莉莉 牛良
为获得抗病毒的转基因植物新材料，采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体，并对苹果砧木材料Ｍ２６进行了遗传转化，成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料，反转录合成ｃ ＤＮＡ第一链，采用ＰｃＲ方法克隆获得了４８９ ｂＰ的ＡＳＰＶ外壳蛋白基因的保守片段，通过ＴＯＰＯ克隆技术将该基因片段连接进入载体Ｐ ＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ，构建了入门克隆载体Ｐ ＥＮ－ＡＳＰＶ，再通过ＬＲ反应置换该片段连接进入目标载体Ｐ ＨＥＬＬＳｇＡＴＥ１２，构建了ＲＮＡｉ植物表达载体ＰＨＥ－ＡＳＰＶ，并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株ＥＨＡ１０５中，获得了可用于植物遗传转化的工程菌ＥＨ－ＡＳＰＶ。采用农杆菌介．．．
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张进忠 孙嘉曼 李朝生 刘挺燕 范燕萍
【目的】AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息。【方法】克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体p DONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体p Jawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化。【结果】成功构建p DONR221-AGPase入门克隆与p Jawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株。【结论】采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调。
[期刊] 华北农学报
[作者]
公鑫 王业红 张剑峰 迟胜起
RPP13是一种能够通过识别病原物效应子诱发植物免疫反应的典型R基因。植物病毒学实验室前期对马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)所侵染的5个马铃薯品种进行了转录组测序分析，发现RPP13基因在5个马铃薯品种中均上调。为了研究该基因在马铃薯中是否与PSTVd抗性相关，应用DNAMAN 8.0软件对转录组测序所得到的RPP13上调基因序列进行序列比对分析，选取其共同的保守区域作为沉默对象，构建了以该保守区域为臂，马铃薯体细胞胚发生激酶类似受体基因(SERK1)(登录号为EF175216)内含子为环的茎环结构反向重复序列RNAi载体pROKⅡ-RPP13,通过冻融法将pROKⅡ-RPP13载体转入农杆菌LBA4404中，应用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法转化马铃薯品种民丰红，以苗龄28 d的健康马铃薯叶片为材料，经过预培养2 d、农杆菌浸染10 min、黑暗条件下共培养2 d,应用抗性筛选培养基诱导生根、生芽，将再生植株进行PCR检测，筛选得到3株阳性转基因植株；以马铃薯的ef1a基因作为内参基因，利用实时荧光定量PCR技术检测马铃薯转化植株中RPP13基因的表达量。结果表明：所获得的3株转基因植株中RPP13基因的表达量与未转基因的对照相比具有显著差异，在所获得的RNAi转基因马铃薯植株中，RPP13基因表达量的降低幅度为35%～60%。
[期刊] 华北农学报
[作者]
张森燕 吴忠义 张秀海 刘占磊 王永勤 黄丛林
构建了ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体,以bar基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将构建的两个表达载体分别转化到玉米自交系178。收获的种子播种于营养钵中,出苗后,经0.1%的草丁膦筛选得到40株草丁膦抗性植株,进一步用PCR鉴定与PCR-Southern检测得到33株转基因植株,其中15株是转化正义表达载体的转基因植株,18株是转化RNAi表达载体的转基因植株。并对转化方法和ZmPti1基因的功能进行了讨论。
[期刊] 草业科学
[作者]
张亚楠 蔺银鼎 孟林 毛培春 田小霞 郭强
重金属ATP酶基因HMA2介导的Cd长距离运输对植物体内Cd的分配及解毒起重要作用。然而,有关马蔺(Iris lactea)体内Cd长距离运输的分子机制仍不清楚。本研究以马蔺根中总RNA为模板,采用RT-PCR方法获得了重金属ATP酶基因片段,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,采用酶切和连接的方法,构建了CaMV35S启动子驱动的含有IlHMA2基因片段反向重复序列的RNAi植物表达载体pARTG1G2,用冻融法将此重组质粒导入农杆菌GV3101,并转入到马蔺幼苗体内获得了Il
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
田绍泽 王雨 岳远征 杨赵楠 胡惠蓉
为鉴定在矮牵牛中筛选到的花药发育早期特异表达基因PhGRP的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体,同源转化矮牵牛并进行了表型观测。与野生型对照相比,转基因矮牵牛植株的整体外观形态没有发生明显的变化,但其花器官的大部分形态指标均显著增大;花粉粒染色及离体培养表明其育性(包括活力和萌发力)显著降低;扫描电镜观察发现花粉粒大都畸形,外壁纹饰粗大;半薄切片结果显示,花药绒毡层发达且降解缓慢,推测绒毡层的发育异常为导致花粉粒败育的主要原因。
关键词：
矮牵牛 RNAi 花粉粒 育性 绒毡层
[期刊] 华北农学报
[作者]
于丛丛 马俊莲 宋春丽 陈佳
据已测序的上西早生柿ETR5基因序列,设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase基因片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,定向连接到植物表达载体pSMAK321的35S启动子和NOS终止子之间,构建成Uenishiwase-ETR5基因的RNA干扰植物表达载体。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA101中。以上西柿组培苗叶片为外植体,优化遗传转化体系,结果表明:农杆菌重悬液和共培养基中均添加200μmol/L的AS及Spc梯度筛选能有效提高转化率。转化植株经PCR检测得到7...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
闵东红 陈阳 霍冬英 胡笛 赵月 徐兆师 张小红 李连城 陈明 马有志
干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质。ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子。本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi。采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制。本研究为深入分析小麦ERF基因的...
[期刊] 华北农学报
[作者]
斯钦巴特尔 张辉 贾霄云 高风云 张立华 任龙梅
亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
康国章 肖向红 王永华 郭天财 朱云集 官春云
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。
关键词：
普通小麦 淀粉合成酶II基因 表达载体
[期刊] 西南农业学报
[作者]
任秀艳 乔洁 张江丽
根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pB...
关键词：
RS基因 基因沉默 载体构建
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 赵海平 杨福合 邢秀梅 刘国庆 李春义
研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S...
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