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[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
李芳 邓子牛 赵亚 李大志 戴素明
基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用No
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李芳 邓子牛 赵亚 李大志 戴素明
【目的】构建柑橘衰退病毒（Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ，Ｃｔｖ）含ｐ２３的ｒＮａｉ载体，以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性，根据ＮＣＢｉ公布的Ｃｔｖ基因组序列，查找ｐ２３保守序列，设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体ｐ Ｂｉ １２１进行双酶切和连接来构建ｒＮａｉ载体。初步预测所构建的载体发生ｒＮａｉ抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含ｒＮａｉ载体的农杆菌注射入Ｃｔｖ指示植物墨西哥莱蒙的叶片，利用Ｇｕｓ组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种Ｃｔｖ ｔ３６基因型，利用酶联免疫反应（ｅＬｉｓａ）．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘永清 周常勇 周彦
本文从选育和利用抗(耐)柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)的柑橘品种和砧木、弱毒株交叉保护、转基因诱导的CTV抗性等方面综述抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展,并就人工miRNA(artificalmicroRNA,amiRNA)介导抗性加以展望,旨在为更好地控制CTV危害提供借鉴。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
张凌云 贝学军 钟广炎
用RT–PCR克隆柑橘的CsERF1基因cDNA序列,并连接到TA克隆载体pMD–19T上;经限制性内切酶2次双酶切,CsERF1基因的正、反向片段被分别插入到双元质粒pFGC5941查耳酮合成酶A(CHSA)内含子的两端,构成反向重复序列;经菌液PCR和测序验证,成功构建了CsERF1基因的RNA干涉载体;通过农杆菌介导法转化柑橘,已获得部分抗性芽。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王永江 周彦 李中安 苏华楠 黄爱军 唐科志 周常勇
【目的】建立一种反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermalamplification,RT-LAMP)检测柑橘衰退病毒(Ctrus tristeza virus,CTV)的一步法检测技术。【方法】根据CTV保守的p25设计2对特异性引物,对RT-LAMP体系的最佳反应条件、特异性、灵敏度等进行研究。【结果】建立了一种特异性检测CTV的RT-LAMP方法,该方法的灵敏度比RT-PCR方法高100倍,产物通过Acc I酶切得到验证,而且反应产物中加入SYBR Green I可直接观察样品是否感染CTV。【结论】RT-LAMP法...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
褚文辉 赵海平 杨福合 邢秀梅 刘国庆 李春义
研究十型胶原蛋白(Collagen type Ⅹ,Col Ⅹ),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col Ⅹ基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24 h后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000g离心5 min,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
易龙 周常勇 周彦 王志刚 唐科志
【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒(CTV)分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增,利用RFLP和SSCP对CPG进行分析,并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主;这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5%～99.5%和95.0%～100%;与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析,其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王彩霞
利用3种不同来源的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)抗体(PAb-L5、PAb-I、MAbs-S4)对武汉地区发生的CTV进行检测,筛选到一个表现特异血清学性状的分离物CTV-HB1,该分离物仅同来源于中国的多克隆抗体PAb-L5发生血清学反应。为揭示该血清学差异的分子机制,对CTV-HB1和其他几个分离物CP基因序列进行了分析,结果显示:CTV-HB1CP基因与其他19个分离物的核苷酸序列相似性在90.4%~99.4%,但CTV-HB1和CTV-L5的CP基因氨基酸序列间仅存在3个位点的变异,暗示:此3个氨基酸位点可能与CTV-HB1的血清学特性有关。
关键词：
柑橘衰退病毒 CP基因 抗体 序列分析
[期刊] 华北农学报
[作者]
田莉莉 牛良
为获得抗病毒的转基因植物新材料，采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体，并对苹果砧木材料Ｍ２６进行了遗传转化，成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料，反转录合成ｃ ＤＮＡ第一链，采用ＰｃＲ方法克隆获得了４８９ ｂＰ的ＡＳＰＶ外壳蛋白基因的保守片段，通过ＴＯＰＯ克隆技术将该基因片段连接进入载体Ｐ ＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ，构建了入门克隆载体Ｐ ＥＮ－ＡＳＰＶ，再通过ＬＲ反应置换该片段连接进入目标载体Ｐ ＨＥＬＬＳｇＡＴＥ１２，构建了ＲＮＡｉ植物表达载体ＰＨＥ－ＡＳＰＶ，并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株ＥＨＡ１０５中，获得了可用于植物遗传转化的工程菌ＥＨ－ＡＳＰＶ。采用农杆菌介．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李玲娣 周常勇 李中安 田晓 王永江 唐科志 周彦 刘金香
【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104....
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘永清 曹孟籍 王雪峰 李中安 唐科志 周常勇
【目的】探寻一种快速、简便、灵敏而可靠的检测植物组织和单头蚜虫中柑橘衰退病毒的方法。【方法】运用反转录多聚酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)、反转录巢式多聚酶链式反应(reverse transcription nested polymerase chain reaction,RT-nested-PCR)、印记捕获反转录巢式多聚酶链式反应(print capture reverse transcription nested polymerase chain reaction,PC-RT-nested-PCR...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
刘莉 刘鹏 金佳丽 吴海丽 王改改 江晨 采克俊
Mx蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白。以PolyI∶C诱导的草鱼(Ctenopharyngodon indellus)肾细胞(CIK cells)为材料,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法扩增出Mx基因cDNA全序列,连接至pMD20-T载体上,构建重组质粒pMD20-T-Mx,并测序进行序列分析。用限制性内切酶从克隆的重组质粒pMD20-T-Mx上切下Mx基因,插入到质粒pEGFP-C1中,构建真核表达载体pEGFP-C1-Mx。结果显示,该基因cDNA全序列为1 921 bp,阅读框共编码627个氨基酸,分子量约为71.1 ku,理论等电点pI为8.33,其编码的...
关键词：
草鱼 Mx基因 克隆 序列分析 载体构建
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
乔芬 祁鹏志 伏卉 张鹏 吴珊 姜玲
以带毒柑橘品种为试材,采用植物中药制剂处理与热处理结合、茎尖微芽嫁接与植物中药制剂处理结合,用RT-PCR法检测病原带毒情况,并在药剂处理后1、3、5、7、9 d取样,检测抗性相关酶活性的含量变化,结果表明:采用板蓝根和黄芩混合中药制剂处理8次,结合热处理,在PC板制成的温室(白天40℃(6 h/d),晚上25℃,处理50 d)中,可有效地脱除试验苗木中柑橘衰退病和柑橘碎叶病复合感染病原;对柑橘茎尖微芽嫁接苗进行板蓝根和黄芩混合中药制剂脱毒处理后苗木经RT-PCR法检测表明:85.7%植株可以脱除柑橘衰退病和柑橘碎叶病病毒;药剂处理后PPO、POD、SOD酶活性与对照相比均有所提高。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
朱贵明 陈宏 高强 陈红星 邓继先
为了建立有效地用于转基因动物生产的慢病毒表达系统,以线虫C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因(sFat-1)为目的基因构建了慢病毒表达载体,通过与慢病毒包装载体PLP1、PLP2和PLP/VSVG一起共转染293FT细胞系生产了慢病毒颗粒,并对其感染哺乳动物细胞NIH3T3细胞系的能力进行了检测。结果表明,该系统所生产的病毒滴度约为5.0×106TU/mL,这种病毒能够感染哺乳动物细胞,说明构建的慢病毒表达系统是有效的,应用其可以生产感染力良好的慢病毒颗粒,并高效地进行sFat-1基因转移。
[期刊] 华北农学报
[作者]
苑博华 蒋继志 刘红梅
分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。
关键词：
PRRSV 基因克隆 原核表达 真核表达
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