根据pthA基因和溃疡病病菌大质粒序列设计特异性引物,利用long-PCR方法,获得了包括pthA完整编码区及两端部分非编码区在内的约4100bp的DNA片段,再利用net-PCR获得了pthA完整的编码区,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后将其克隆到植物表达载体pBI121中.经双酶切及核酸序列测定鉴定的阳性克隆重组质粒被命名为pBI-pthA.序列分析结果表明,克隆得到的pthA与登录到Genbank上的pthA序列有99.8%的同源性,pthA全长基因编码1163个氨基酸,具有17.5个102bp单元的重复序列,每个单元编码34个氨基酸,重复区后有1个亮氨酸拉链结构(LZ),3个核定位信号(N...

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR_1和LRR_2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。

利用三氯乙酸-丙酮法、Tris-HCl提取法、改良PBS法提取柑橘叶片蛋白质,对提取蛋白质进行SDS-PAGE电泳、质谱鉴定和Western blot分析,结果表明,用改良PBS法提取的蛋白质质量浓度达30μg/μL,其SDS-PAGE电泳条带清晰,无杂质干扰,能达到质谱对样品的要求.Western blot分析结果表明,与抗柑橘溃疡病相关的PthA蛋白质在转pthA-nls基因糖橙和转pthA-nls基因冰糖橙中成功表达,pthA-nls基因已整合进甜橙基因组,表达蛋白质具有免疫反应活性.

[目的]为了明确重庆樟树溃疡病的病原菌种类。[方法]采集重庆市渝中区、北碚区和涪陵区的樟树溃疡病样品进行病原菌的分离与纯化,观察病原菌的形态学特征,对不同菌落形态代表菌株的rDNA-ITS、β-tubulin和EF1-α序列进行扩增和测序,构建系统进化树,并测定其致病性。[结果]从重庆不同地区采集的樟树溃疡病样品中共分离得到48份菌株,单菌丝纯化后得到68株纯化菌株,根据纯化菌株在PDA培养基上的培养特性及分生孢子特征,将其分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3种类型。选取不同类型的代表菌株构建系统进化树,结果表明:这3类菌株分别为葡萄座腔菌属中的Botryosphaeria dothidea、B.parva和B.rhodina。致病性测定结果发现:所有菌株均能使樟树枝条产生黑色坏死病斑,且B.parva菌株的致病性最强,B.rhodina菌株的致病性次之,B.dothidea菌株的致病性最弱。[结论]重庆樟树溃疡病的病原菌为B.dothidea、B.parva和B.rhodina,其中B.rhodina和B.parva为引起樟树溃疡病的首次报道。

【目的】分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子Cs BZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系。【方法】基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的Cs BZIP40所属

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.

为研究柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的关联性,于2017年4月-2018年10月,在湖北省秭归县郭家坝镇柑橘溃疡病发生区域进行了相关研究。通过田间和显微观察发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病之间存在危害部位的同步性,并观察到溃疡病菌沿潜叶蛾虫道延伸传播的现象;同时发现柑橘溃疡病症状随柑橘潜叶蛾的为害而发生改变,即在病虫高发期,溃疡病病斑常以粉末状出现。通过对秭归县20 a的潜叶蛾百叶虫量、溃疡病发生面积及病情指数等数据分析发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病在消长动态上存在年度间和年度内的同步性;对潜叶蛾虫道内的病原菌进行鉴定,证明潜叶蛾虫道内病原菌即为溃疡病病原菌。柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的田间交互症状和消长动态上的同步性,揭示了柑橘潜叶蛾对柑橘溃疡病的影响途径,表明柑橘潜叶蛾是柑橘溃疡病快速扩散、加重发生的重要因子,预示了控制潜叶蛾发生对防治柑橘溃疡病的重要作用。

从辽宁的本溪、沈阳、抚顺、鞍山等地采集疑似高致病性蓝耳病病料,将采集的肺和淋巴结分别研磨,离心并制备成病毒悬液,用试剂提取RNA,将提取出的RNA反转录成cDNA,然后用特异性引物对目的片段进行克隆扩增,最后将所得目的片段测序并与国内其他分离株进行序列分析。结果获得480bp特异性高致病性蓝耳病病毒N基因片段,与国内其他地区高致病性蓝耳病病毒分离株的N基因相比较,核苷酸序列同源性在91.1%以上,氨基酸序列同源性在98.6%以上,表明高致病性蓝耳病病毒辽宁地区分离株与国内其它分离株亲源关系较近,属于同一分支。

水稻条斑病细菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xooc)和水稻白叶枯病菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)是稻黄单胞菌种下的致病变种,是水稻上的模式病原菌。用Xoo无毒基因avrXa3对应的NLS和AD区域的DNA片段构建探针,筛选Xooc基因文库,再通过酶切归类和Southern杂交分析,从Xooc中获得2个avBs3r/PthA家族基因克隆,分别被命名为avr/Pth13和avr/Pth14。序列测定结果显示,它们与avrBs3PthA家族成员,几乎一样的5′端和3′端、1个亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ)、3个核定位信号(nucle...

【背景】柑橘溃疡病(citrus bacterial canker,CBC)是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙(Citrus sinensis)的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生型植株的转录组测序结果,探究CsWRKY61提高柑橘溃疡病抗性的内在机制。【结果】分别构建了CAMV 35S启动子控制CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72表达的植物表达载体,通过GUS组织化学染色和PCR鉴定分别获得了6、8和6株转基因晚锦橙。转基因植株中目的基因的表达量有不同程度的提高,大部分转基因植株中外源基因的拷贝数为1,只有超量表达CsWRKY61的转基因植株溃疡病抗性显著增强,其病斑面积明显小于野生型植株,而超量表达CsWRKY50和CsWRKY72的转基因植株抗病性与野生型相比无明显差异。转录组分析结果显示,超量表达CsWRKY61的转基因植株中生物胁迫相关途径(包括病原入侵的感知、活性氧爆发、转录因子、防御基因、激素、细胞壁和次生代谢等)和信号转导相关途径(主要是激酶受体)均被显著激活。【结论】超量表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;CsWRKY61在柑橘抗病育种中存在潜在的应用价值。

药效试验表明，铜铵合剂对柑橘溃疡病有明显的防治效果，对锦橙夏秋梢溃疡病的防治效果分别达８５．９２％和９０．４５％，且使用安全，原料简单，配制方便，成本低廉。

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参...

采用2216E和TCBS培养基分别从患溃疡病半滑舌鳎的肠道和体表病灶分离获得菌株40株,经血平板检验分离菌株的溶血活性,体外筛选并鉴定出3株潜在致病性菌株,即哈维氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血性弧菌。通过将3株潜在致病菌与健康半滑舌鳎的肠道上皮细胞共培养,检测病原菌刺激后半滑舌鳎肠道上皮细胞相关免疫基因的相对表达量及共培养后肠道上皮细胞的凋亡率,对病原菌的致病性进行细胞水平的筛选。结果显示,经哈维氏弧菌刺激后肠道上皮细胞白介素10基因(IL-10)表达量极显著上调,说明哈维氏弧菌引起的共培养上皮细胞免疫反应最为剧烈,且哈维氏弧菌与肠道上皮细胞共培养后导致细胞的凋亡率高达48.3%,其次为溶藻弧菌(36%)和副溶血性弧菌(34.5%),推测哈维氏弧菌为半滑舌鳎溃疡病高致病性弧菌。通过对半滑舌鳎进行浸浴回感实验,结果发现,哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌人工回感后第6天半滑舌鳎的累计死亡率分别为100%、95%和75%,与细胞水平检测结果相吻合。实验表明,所筛选到的3株弧菌均具有较强的毒性和致病性,尤其以哈维氏弧菌致病性最强,并由此推测半滑舌鳎溃疡病可能由多种致病菌共同感染所致。

从四川、湖北两省收集的柑桔病样分离出2个溃疡病菌株,经生物学和PCR鉴定后,分别针刺接种于纽荷尔脐橙、福本脐橙、卡拉卡拉脐橙和春见桔橙等4个柑桔品种;接种2 d后调查发病情况,使用DPS软件8.01的Duncan新复极差法进行分析。结果表明,接种后4 d是最佳观察时期,4个柑桔品种分别接种上述菌株后发病率无明显差异,老叶和成叶的发病率要高于嫩叶的发病率,叶片不同部位之间的发病率也基本相当,桔橙的抗病性要高于脐橙的抗病性。

果实成熟特异基因对于调控果实成熟及其品质形成具有重要的作用。在前期获得柑橘Citrus果实成熟特异基因片段的基础上,以纽荷尔脐橙Citrus sinensis‘Newhall’成熟果实为试材,应用RT-PCR和RACE技术,分离获得果实成熟特异基因的cDNA全长序列,命名为CsPMEI/InvI,GenBank登录号:KC198084;生物信息学分析表明:该基因全长945 bp,包含618 bp完整的开放阅读框,编码205个氨基酸,其编码的蛋白质分子式为C977H1568N296O282S10,相对分子量为22.29 kDa,理论等电点为9.84,属于InvI/PMEI(转化酶抑制子/果胶甲酯...