【目的】筛选鉴定柑橘溃疡病菌拮抗菌,研究其培养特性及拮抗物质的初步性质,为柑橘溃疡病的生物制剂研制奠定基础。【方法】利用对峙培养法筛选对柑橘溃疡病菌具有良好抑制作用的生防菌,并通过对菌株形态、生理生化特征以及16SrDNA序列分析鉴定其分类地位;以单因素试验和正交设计方法对影响CQBS03菌株抑菌活性物质产生的各种培养条件进行优化;利用硫酸铵沉淀获得抑菌物质粗提物并测定其对温度、蛋白酶及氯仿的敏感性。【结果】经鉴定CQBS03为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。CQBS03抑菌活性成分主要存在于培养液中,能被80%饱和度硫酸铵沉淀,最高可耐受的温度范围为60～70℃;活性成分在2...

从湖南衡阳、常德、长沙、永州等地的柑橘园采集标本,分离、筛选柑橘叶表微生物,共分离到225株细菌,9株真菌.平板拮抗试验结果表明,其中6个菌株有较好的防效,占分离菌株的13.7%.通过对菌株过滤液和定殖力的测定,菌株Kx15和Kx48效果明显,在温室对柑橘溃疡病的防治效果分别达到45.6%和55.6%,在重病果园中的防治效果分别为40.3%,47.7%,且Kx48要优于Kx15.菌株Kx15初步鉴定属于葡萄糖杆菌属,Kx48属于乳酸杆菌属.

为研究柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的关联性,于2017年4月-2018年10月,在湖北省秭归县郭家坝镇柑橘溃疡病发生区域进行了相关研究。通过田间和显微观察发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病之间存在危害部位的同步性,并观察到溃疡病菌沿潜叶蛾虫道延伸传播的现象;同时发现柑橘溃疡病症状随柑橘潜叶蛾的为害而发生改变,即在病虫高发期,溃疡病病斑常以粉末状出现。通过对秭归县20 a的潜叶蛾百叶虫量、溃疡病发生面积及病情指数等数据分析发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病在消长动态上存在年度间和年度内的同步性;对潜叶蛾虫道内的病原菌进行鉴定,证明潜叶蛾虫道内病原菌即为溃疡病病原菌。柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的田间交互症状和消长动态上的同步性,揭示了柑橘潜叶蛾对柑橘溃疡病的影响途径,表明柑橘潜叶蛾是柑橘溃疡病快速扩散、加重发生的重要因子,预示了控制潜叶蛾发生对防治柑橘溃疡病的重要作用。

【目的】杨树溃疡病是中国杨树人工林重大生物灾害之一,采用生物防治的方法控制杨树溃疡病是持续有效的手段。本研究旨在从杨树林地土壤中分离出对杨树溃疡病菌有良好生防效果的拮抗微生物。【方法】以杨树溃疡病病原菌葡萄座腔菌为靶标,进行土壤中生防微生物的分离、筛选和鉴定。土壤微生物的分离采用稀释平板涂布法;拮抗微生物的筛选分为初筛、发酵液复筛和拮抗菌株离体复筛3步,初筛采用平板对峙法,拮抗菌发酵液复筛选择三明治法和改良琼脂扩散法相结合的方法,最终通过离体组织防治效果测定确定目的生防菌株;生防菌株的鉴定采用形态学观察和分子生物学鉴定相结合的方法。【结果】在河北省廊坊市和河南省原阳县的杨树林地中按上、中、下3...

药效试验表明，铜铵合剂对柑橘溃疡病有明显的防治效果，对锦橙夏秋梢溃疡病的防治效果分别达８５．９２％和９０．４５％，且使用安全，原料简单，配制方便，成本低廉。

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌C...

【目的】溃疡病是严重危害柑橘的一种细菌性病害,通常在高温下容易发生。论文旨在阐明高温下柑橘易发生溃疡病的机制,揭示其代谢变化,为利用药剂防治溃疡病提供重要的理论指导。【方法】以感病的甜橙(Citrus sinensis)为研究对象,在21℃和30℃下预培养3 d,然后均接种同样浓度(108 cfu/m L)的柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)10μL,比较两组植株的发病率,采用半定量RT-PCR分析两种温度下4个抗病基因AOS、CHI、GPX和PR4A的表达量,利用HPLC测定预培养3 d后叶片内源多胺(腐胺、亚精胺和精胺)的含量。在此基础上,利用外源亚精胺(0.4 mmol·L-1)处理甜橙植株(以清水处理为对照),比较亚精胺和清水处理的植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数,分析亚精胺处理对内源多胺含量和抗病基因AOS、CHI、GPX和PR4A表达的影响。【结果】溃疡病菌接种后观察发现,21℃培养植株溃疡病的发病率在前期低于30℃培养的植株,至第10天时,两个处理组植株的发病率接近;同时HPLC测定发现,21℃培养植株叶片3种自由态多胺(腐胺、亚精胺和精胺)含量高于30℃培养植株;RT-PCR分析表明,CHI、GPX和PR4A这3个抗病基因的表达量在21℃培养植株中高于30℃培养植株,而AOS表达水平在两组材料中差异不明显。外源亚精胺处理显著增加了内源腐胺和亚精胺的含量,降低了所处理植株接种溃疡病菌后的发病率和病情指数,接种后14 d发病率比对照降低45%,病情指数比对照降低4.8,而由表型可见对照发病程度重于亚精胺处理材料。此外,亚精胺处理能够增强AOS、CHI、GPX和PR4A 4个抗病基因的表达量。【结论】高温下甜橙更易发生溃疡病的可能机制是高温抑制抗病基因的表达和多胺合成。外源多胺处理能够降低甜橙发生溃疡病,可能机制是多胺处理后增强了抗病基因的表达,诱发植株的抗病反应最终表现出抗病。因此,高温是影响溃疡病发生的一个关键环境因子,多胺有助于提高对柑橘溃疡病的抗性。

本文对云南昆明地区由Phomopsis amygdali侵染引起的桃树溃疡病进行了鉴定。采集受害病枝到实验室分离培养,进行形态学鉴定。结果表明:分离菌在PDA培养基上菌落灰色、绒毛状,从菌落的背面可看到有淡褐色的色素形成;分生孢子无色、子弹状、双细胞,大小为3.7μm×8.7μm。进行ITS系列分析:提取其基因组DNA,PCR扩增产物测序,对所测序列在NCBI中进行Blastn分析比对,结合在寄主植物上的症状,分离菌的生物学特性等,判断该分离病菌为桃溃疡病菌Phomopsis amygdali。最后进行回接实验,把分离到的病菌接种到健康的桃果实上,观察接种桃子发病情况及症状,比较从发病桃子上再...

【目的】从生防菌株产生的拮抗作用酶及生防菌株对病原菌生长的影响2方面研究黄绿木霉(YGF9)和木贼镰刀菌(LX6F2)对杨树溃疡病病菌葡萄座腔菌的抑菌机制,为杨树溃疡病的生物防治提供参考。【方法】通过生防菌株在几丁质培养基、纤维素培养基、β-l,3-葡聚糖培养基和酪蛋白培养基上的反应和生长情况,判定生防菌株能否产生几丁质酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶;通过显微镜观察2种生防菌株对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响。【结果】菌株YGF9和LX6F2代谢过程中均能使β-1,3-葡聚糖培养基中的蓝色消失,说明2种菌株具有产β-1,3-葡聚糖酶的能力;2种菌株可以在酪蛋白培养基上形成水解圈,说...

刺槐溃疡病在山东沿海地区发生严重。研究结果表明主要病原菌为尖镰孢（ＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍＳｃｈｌｅｃｈｔ．），其次为腐皮镰孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ（Ｍａｒｔ．）Ｓａｃｃ．）。尖镰孢的小型分生孢子头状，聚生于短的单出瓶梗上，分生孢子椭圆形至腊肠形，７．６～１５．４μｍ×２．５～３．８μｍ；大型分生孢子镰刀形至纺锤形，３～５分隔，２８．２～３８．４μｍ×４．６～５．１μｍ；厚垣孢子直径８．９～１２．８μｍ。腐皮镰孢的小型分生孢子生于伸长的分生孢子梗上，阔卵形至椭圆形，５．１～１０．２μｍ×２．５～４．８μｍ，孢子梗长３０～８０μｍ；大型分生孢子两端较钝，３～５分隔，２０．１～３...

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR_1和LRR_2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。

【背景】柑橘溃疡病(citrus bacterial canker,CBC)是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙(Citrus sinensis)的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生型植株的转录组测序结果,探究CsWRKY61提高柑橘溃疡病抗性的内在机制。【结果】分别构建了CAMV 35S启动子控制CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72表达的植物表达载体,通过GUS组织化学染色和PCR鉴定分别获得了6、8和6株转基因晚锦橙。转基因植株中目的基因的表达量有不同程度的提高,大部分转基因植株中外源基因的拷贝数为1,只有超量表达CsWRKY61的转基因植株溃疡病抗性显著增强,其病斑面积明显小于野生型植株,而超量表达CsWRKY50和CsWRKY72的转基因植株抗病性与野生型相比无明显差异。转录组分析结果显示,超量表达CsWRKY61的转基因植株中生物胁迫相关途径(包括病原入侵的感知、活性氧爆发、转录因子、防御基因、激素、细胞壁和次生代谢等)和信号转导相关途径(主要是激酶受体)均被显著激活。【结论】超量表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;CsWRKY61在柑橘抗病育种中存在潜在的应用价值。

选取不同浓度的柑橘溃疡病菌SOB培养液,利用载玻片进行固定、封闭、抗体结合、免疫荧光标记及荧光强度检测,以探讨免疫荧光检测技术在柑橘溃疡病菌快速检测方面的应用。结果表明,30℃下用BSA封闭2h,30℃下抗体结合1 h,荧光抗体浓度为4μg/mL,室温放置40 m in后,在荧光显微镜下可以清楚看到绿色的柑橘溃疡病菌体。该方法操作简便,检测过程仅需4 h,抗原抗体反应特异性极强,检测灵敏度可达103cfu/mL。

海洋是当前放线菌资源的重要来源,由于其独特的生态环境造就了代谢系统多样的放线菌,随着研究的深入,有望获得具有不同抑菌活性的有益菌株。从大连黄海海域海底沉积物样品中分离得到1株放线菌YH23,为进一步开发其在生物防治中的应用潜力,采用牛津杯法检测其发酵液对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的抑菌活性,并采用单因素试验与正交设计方法筛选出该菌株的最优发酵配方和发酵条件,同时通过形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析初步确定了该菌株的分类地位。结果表明:YH23发酵液对番茄溃疡病菌(Cmm)具有抑制活性;其优化后的发酵培养基组分为黄豆粉10g,地瓜粉10g,氯化钠2g,碳酸钙1g,去离子水1L;优化后的发酵条件为初始pH值6.0,发酵温度25℃,发酵时间5d,接种量8%,装液量75mL/250mL,转速为150r·min-1,优化后发酵液的最佳抑菌圈直径较初始发酵液增大47.2%;该菌株16S rDNA序列与密旋链霉菌(Streptomyces pactum NBRC 13433T)相似度为99.58%,聚类分析显示二者亲缘关系最近,结合形态特征及生理生化特性最终确定该菌株YH23为密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。

从患溃疡病养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出3株优势菌(RH1、RH2、RH3),以浸浴、体腔注射、体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株RH2为养殖刺参溃疡病的病原菌,其对刺参的LD50(半数致死量)每尾为5.68×106CFU,并证实浸浴、体腔注射的方式无法感染刺参,该菌可能通过体表创伤侵入的方式感染刺参。经形态学观察、生理生化特性分析、16SrRNA和HSP60基因测序确定菌株RH2为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示,菌株RH2与溶藻弧菌(AF513447)亲缘关系最近,置信度为50%;...