【目的】分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子Cs BZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系。【方法】基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的Cs BZIP40所属

【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。

根据pthA基因和溃疡病病菌大质粒序列设计特异性引物,利用long-PCR方法,获得了包括pthA完整编码区及两端部分非编码区在内的约4100bp的DNA片段,再利用net-PCR获得了pthA完整的编码区,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切后将其克隆到植物表达载体pBI121中.经双酶切及核酸序列测定鉴定的阳性克隆重组质粒被命名为pBI-pthA.序列分析结果表明,克隆得到的pthA与登录到Genbank上的pthA序列有99.8%的同源性,pthA全长基因编码1163个氨基酸,具有17.5个102bp单元的重复序列,每个单元编码34个氨基酸,重复区后有1个亮氨酸拉链结构(LZ),3个核定位信号(N...

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域(LRR_1和LRR_2);构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP(GSVIVT01033370001)遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个(OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14)为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系(8个株系)进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降(为野生型的23.12%—75.49%),其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。

【目的】为了明确欧美杨细菌性溃疡病病原菌ｈｒｃ Ｊ基因在致病过程中的作用，解析病原菌Ⅲ型分泌系统各基因的功能，为阐明病原菌的致病机制提供理论依据。【方法】利用同源重组原理，构建携带菌株Ｎ－５－１ ｈｒｃ Ｊ基因的自杀载体ｐ ＥＸ１８Ｋｍ－ｈｒｃ Ｊ，运用两亲结合方法把自杀载体导入野生型Ｎ－５－１菌株中，在含有相应浓度的卡纳霉素和利福平抗生素的ＬＢ平板上筛选得到ｈｒｃ Ｊ基因的插入突变体，并通过ｐｃｒ和ＳｏｕｔｈＥｒＮ杂交验证。为进一步验证ｐ ＥＸ１８Ｋｍ－ｈｒｃ Ｊ是否定点整合入ｈｒｃ Ｊ基因，设计了２对引物组合进行ｐｃｒ扩增。在室内生化培养箱内，分别以野生型菌株Ｎ－５－１、插入突变体菌株Δｈ．．．

分离猕猴桃溃疡病菌中的质粒,从质粒角度探索细菌的致病机制,分析其编码的主要基因、毒力因子。用试剂盒提取分离自安徽省岳西县猕猴桃溃疡病菌株JF8的质粒,对质粒DNA进行高通量测序及生物信息学分析。质粒基因组拼接显示菌株JF8质粒全长65 149bp,GC含量56.29%,包含45个假定蛋白(hypothetical protein)和38个有预测功能的蛋白。生物信息学分析发现,质粒携带多达8个直接参与基因重组和转移的转运蛋白(mobile element protein),5个基因直接参与细菌Ⅳ型分泌系统、1个基因参与细菌Ⅲ型分泌系统。基因ParA编码的蛋白是一个ATP酶,对质粒的分配以及维持质粒稳定具有重要作用,编码转录激活蛋白的基因LuxR与细菌的群体感应机制相关,影响毒力因子的表达和分泌,基因UmuC是细菌中SOS应答系统的组分之一,控制细胞中聚合酶Ⅴ的量。

【背景】柑橘溃疡病(citrus bacterial canker,CBC)是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙(Citrus sinensis)的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生型植株的转录组测序结果,探究CsWRKY61提高柑橘溃疡病抗性的内在机制。【结果】分别构建了CAMV 35S启动子控制CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72表达的植物表达载体,通过GUS组织化学染色和PCR鉴定分别获得了6、8和6株转基因晚锦橙。转基因植株中目的基因的表达量有不同程度的提高,大部分转基因植株中外源基因的拷贝数为1,只有超量表达CsWRKY61的转基因植株溃疡病抗性显著增强,其病斑面积明显小于野生型植株,而超量表达CsWRKY50和CsWRKY72的转基因植株抗病性与野生型相比无明显差异。转录组分析结果显示,超量表达CsWRKY61的转基因植株中生物胁迫相关途径(包括病原入侵的感知、活性氧爆发、转录因子、防御基因、激素、细胞壁和次生代谢等)和信号转导相关途径(主要是激酶受体)均被显著激活。【结论】超量表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;CsWRKY61在柑橘抗病育种中存在潜在的应用价值。

【目的】明确csi-miR399响应柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染的表达模式，筛选其靶基因，进而分析csi-miR399与寄主Xcc抗性的相关性，为柑橘溃疡病抗性种质的创制打下基础。【方法】分别以柑橘溃疡病抗性品种四季橘（Citrus microcarpa）和感病品种纽荷尔脐橙（Citrus sinensis）为试材，通过茎环qPCR方法分析csi-miR399在叶片离体注射Xcc 1、3和5 d时的表达量变化，明确抗/感品种中csi-miR399响应Xcc侵染的表达模式；利用在线软件psRNATarget预测csi-miR399的靶基因，并通过qPCR分析候选靶基因在接种Xcc柑橘叶片和瞬时表达csi-miR399叶片中表达量的变化；克隆csi-miR399前体基因序列，通过同源重组方法构建病毒表达载体pCLBV202-MIR399，根癌农杆菌介导的真空浸润法接种尤力克柠檬（Citrus limon），通过qPCR分析csi-miR399表达量；进而采用离体叶片针刺法接种Xcc，观察发病症状，统计病情指数，分析csi-miR399过表达对Xcc抗性的影响。【结果】接种Xcc后，csi-miR399在抗病品种四季橘中的表达呈现先下降再上升的趋势，而在感病品种纽荷尔脐橙中的表达呈持续下降趋势。接种Xcc 5 d时，csi-miR399在四季橘与纽荷尔脐橙中的表达量分别是健康对照的4.64倍和7.61%，初步表明csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性相关。从13个预测靶基因中筛选鉴定了csi-miR399的3个靶基因Cs2g06030、Cs7g03830、Cs8g18800，分别编码泛素偶联酶PHO2、未知蛋白和漆酶。利用构建的病毒表达载体pCLBV202-MIR399获得过表达csi-miR399的柠檬植株（Y37、Y41和Y57），与空载体对照pCLBV202接种植株（L35）相比，Y37、Y41和Y57中csi-miR399表达量显著增加，接种Xcc后的溃疡病病斑面积显著减小，病情指数显著降低（P<0.01），表明csi-miR399过表达显著提高了柠檬的溃疡病抗性。【结论】csi-miR399与柑橘的溃疡病抗性密切相关，过表达csi-miR399显著提高柑橘对溃疡病的抗性，可应用于柑橘抗溃疡病的分子育种。

一年生草本植物受到病原菌侵染时,体内的水杨酸甲基转移酶(salicylic acid methyltransferase,SAMT)基因能将植物侵染部位产生的水杨酸(salicylicacid,SA)转化为水杨酸甲酯(methyl salicylate,MeSA),部分MeSA挥发到空气中,在植物的未侵染部位通过水杨酸结合蛋白2(salicylic acid-binding protein 2,SABP2)再次转化为SA,这一过程在SA信号转导和植物系统获得抗性(systemic acquired res

选取不同浓度的柑橘溃疡病菌SOB培养液,利用载玻片进行固定、封闭、抗体结合、免疫荧光标记及荧光强度检测,以探讨免疫荧光检测技术在柑橘溃疡病菌快速检测方面的应用。结果表明,30℃下用BSA封闭2h,30℃下抗体结合1 h,荧光抗体浓度为4μg/mL,室温放置40 m in后,在荧光显微镜下可以清楚看到绿色的柑橘溃疡病菌体。该方法操作简便,检测过程仅需4 h,抗原抗体反应特异性极强,检测灵敏度可达103cfu/mL。

【目的】研究杨树受溃疡病菌感染后转录因子的应答变化。【方法】提取诱导前后的毛白杨树皮mRNA,反转录生成cDNA,构建接种溃疡病菌72 h后的SSH-cDNA库,从库中获得ESTs,将ESTs注释到Unisequences,挑选出与转录相关的Unisequences,利用RT-qPCR对转录基因作进一步的分析。随机挑选199个阳性克隆进行测序,测序结果经与NCBI基因库中序列进行比较,发现172个EST同源序列,对这些EST在db EST数据库进行同源检索分析。【结果】有10个序列与转录相关,占5.8%,分为4类,即:锌指蛋白,含EAR转录区域;类CONSTANS转录因子,编码核蛋白;普通转录...

【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coliBL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要...

通过测定苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑菌活性、菌液的OD600nm值、电导率、蛋白质含量、保护酶和呼吸代谢途径酶活性,探索苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的抑菌机理。结果表明:苋菜乙酸乙酯提取物对柑橘溃疡病菌的室内平板抑菌圈直径在15 mm以上,最低抑菌质量浓度MIC为3.68 mg/m L;苋菜乙酸乙酯提取物不仅延迟了病原菌进入对数生长期的时间,而且使其电导率增加了15%;苋菜乙酸乙酯提取物对过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)的酶活力的抑制率

采用异源表达方法从柑橘黄单胞柑橘亚种(Xcc)中国菌株Xcc 29-1中鉴定出6个编码胞外蛋白水解酶的基因.运用同源重组方法将6个编码基因全部敲除,得到胞外蛋白水解酶缺失突变体,对其致病力、形成生物膜的能力和生长繁殖速度进行检测.结果显示,蛋白水解酶突变体在柑橘上的致病力减弱,并且附着到试管壁的细菌数量显著减少,形成生物膜的能力下降.在野生型菌株中过表达蛋白水解酶后,形成的溃疡病斑水渍状程度加大,在柑橘中的繁殖速度变快;在柑橘叶片中,6个胞外蛋白水解酶基因的转录水平都增强表达.这些结果表明Xcc的胞外蛋白水解酶是一个重要的致病因子.

为研究柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的关联性,于2017年4月-2018年10月,在湖北省秭归县郭家坝镇柑橘溃疡病发生区域进行了相关研究。通过田间和显微观察发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病之间存在危害部位的同步性,并观察到溃疡病菌沿潜叶蛾虫道延伸传播的现象;同时发现柑橘溃疡病症状随柑橘潜叶蛾的为害而发生改变,即在病虫高发期,溃疡病病斑常以粉末状出现。通过对秭归县20 a的潜叶蛾百叶虫量、溃疡病发生面积及病情指数等数据分析发现,柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病在消长动态上存在年度间和年度内的同步性;对潜叶蛾虫道内的病原菌进行鉴定,证明潜叶蛾虫道内病原菌即为溃疡病病原菌。柑橘潜叶蛾与柑橘溃疡病的田间交互症状和消长动态上的同步性,揭示了柑橘潜叶蛾对柑橘溃疡病的影响途径,表明柑橘潜叶蛾是柑橘溃疡病快速扩散、加重发生的重要因子,预示了控制潜叶蛾发生对防治柑橘溃疡病的重要作用。