为建立主要柑橘病毒病准确、快速的分子检测体系,在表现柑橘衰退病(CTV)、柑橘裂皮病(CEV)和柑橘碎叶病(CTLV)典型症状的病树上采叶样提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析.病毒鉴定用的特异引物为CTV3对、CEV2对和CTLV1对.通过不同退火温度的测试,发现所有参试引物均能在56℃退火时扩增出相应的病毒特异带,从而在保证鉴定准确性的前提下,极大地简化了鉴定程序.用建立的RT-PCR体系对云南、重庆、湖南等地有衰退病、裂皮病和碎叶病症状的样品进行检测,结果表明该体系均能对相应病毒进行准确检测.

【目的】建立SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,测定褐色橘蚜(Toxoptera citricida)中柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含量。【方法】根据CTV CP25保守序列,设计特异性引物HD-F/R,通过优化得到最佳反应条件建立橘蚜中CTV实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性检验,评价该方法的可行性。应用该方法测定单头橘蚜中CTV含量。【结果】该实时荧光定量RT-PCR方法最低检测限为9.0拷贝/μL,其灵敏度是常规RT-PCR的100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关性系数为0.998,扩增效率达104....

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒...

【目的】建立快速、准确检测鸭副粘病毒病的方法。【方法】根据GenBank中发表的新城疫F基因序列设计1对引物,扩增鸭副粘病毒融合蛋白基因727bp的特异性片段,进行特异性试验和敏感性试验,建立了鸭副粘病毒病的RT-PCR诊断方法。应用建立的诊断方法,对从山东不同地区分离的20株疑似鸭副粘病毒毒株和150份疑似感染副粘病毒鸭的病变组织进行了检测。【结果】特异性试验表明,建立的RT-PCR检测方法能够从鸭副粘病毒SDFCH株中扩增到727bp的特异性片段,而对鸭瘟病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明,该法最低检出量的cDNA质量浓度为3pg/μL;山东不同地区...

根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。

鹅绒藤（Cynanchum chinense）是一种传统中药，为明确造成鹅绒藤叶片花叶症状的原因，本研究采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR的方法鉴定引起山西太谷鹅绒藤病毒花叶症状的病原，并通过生物信息学的手段对病毒序列进行分析。结果表明，鹅绒藤样品经小RNA深度测序技术共获得15 039 334个原始序列，将拼接contigs与NCBI中的病毒数据库进行比对注释，结果显示为苜蓿花叶病毒（AMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）。利用特异引物克隆了AMV和CMV的外壳蛋白（CP）和移动蛋白（MP）基因全序列，分别命名为AMV-BR和CMV-BR。通过序列比对分析，发现AMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn（MH332899）、Dich-rep（MW835989）和VIC-320（MF075254）的相似性均达到100%；MP氨基酸序列和核苷酸序列与AMV分离物AMV-Gyn（MH332899）的相似性最高，均为99.3％。CMV-BR CP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组ⅠA中CMV分离物YA17（MH119159）的相似性最高，分别为100％和99.1％；MP氨基酸序列和核苷酸序列与CMV亚组Ⅰ分离物PV-0185（ON013887）的相似性最高，分别为98.2％和96.4％。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明，CMV-BR属于CMV亚组Ⅰ中的成员。这是首次在山西鹅绒藤上检测到AMV和CMV，该研究有助于深入了解AMV、CMV的分子进化，也为鹅绒藤病毒病的防治提供一定的理论依据。

采自江苏省南京市郊区的小麦病毒病样品提纯后 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结果表明 ,病毒外壳蛋白 (CP)为单一组分 ,相对分子质量为 36 5× 10 3 。经 1 2g·dL-1琼脂糖凝胶电泳检测 ,病毒核酸有两个组分 ,即RNA1和RNA2。根据AnbeSohn发表的小麦梭条花叶病毒RNA 13′端部分核苷梭序列 ,设计一对引物 ,以提纯样品的RNA1为模板 ,经RT PCR扩增出包含CP基因在内的 1 7kb的特异性目的片段 ,据此鉴定所采集的毒原为小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)。

为明确百合在生产中被病毒侵染的情况,利用高通量测序技术对云南、浙江等地的百合染病样品进行病毒鉴定,通过序列比对和拼接,获得了车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)、百合斑驳病毒(lily mottle virus,LMoV)、大丽花花叶病毒(dahlia mosaic virus,DMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、玄参花叶病毒(figwort mosaic virus,FMV)、玫瑰黄脉病毒(rose yellow vein virus,RYVV)、大丽花普通花叶病毒(dahlia common mosaic virus,DCMV)、木薯脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus,CsVMV)等8种已知病毒和2种未知病毒的序列信息。对从云南、浙江、江西、上海、广东、湖南6个省(市)采集的48份百合样品进行了上述8种病毒的RT-PCR检测。结果显示,在百合样品中,DMV、RYVV、PlAMV和LMoV发生普遍,检出率均高于95%,FMV检出率高于85%,CMV检出率最低,且仅在云南省昆明市的样品中检出,而DCMV和CsVMV未检测到。检测样品中百合病毒复合侵染率为100%,单一样品检测出3～6种病毒,共有6种复合类型,以云南省昆明市的百合病毒复合侵染情况最复杂,昆明的单一样品均有5～6种病毒感染。以上结果表明,所检测地区百合病毒的检出率和复合侵染率都较高,因此,在生产中应实时监控和检测百合植株的带毒情况,及早发现染病植株,防止病毒扩散和传播,以免造成经济损失。

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒...

为深入探索日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的致病机理,并为新型疫苗研发提供技术支持,采用长链RT-PCR技术对其基因组全长cDNA进行了扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3′末端和5′末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV WHe株基因组全长cDNA分子近11 kb大小;非编码区测序分析表明,扩增产物为WHe株所特有。提示长链RT-PCR法可用于JEV WHe株基因组全长cD-NA的扩增。

【目的】检测湖南地区柑橘所携带的柑橘类病毒类型,并鉴定柑橘类病毒的亚型。【方法】以田间柑橘枝条韧皮部为试材,提取总RNA,反转录成cDNA,再用不同类型类病毒的特异引物进行PCR扩增,鉴定出各个样品所携带的柑橘类病毒类型;通过测序分析各类型的序列,并与国内外报道的序列进行同源性分析,确定所测样品的亚型。【结果】建立了CEVd、CVdII、CVdⅢ等柑橘类病毒的RT-PCR检测方法。在5个供试样品中检测出3种类型的柑橘类病毒,即柑橘裂皮病类病毒(citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘类病毒Ⅱ型(citrus viriodⅡ,CVdⅡ,又名hop stunt viroid...

根据猪库布病毒的3 D基因设计1对引物,建立了两步法RT-PCR检测方法,使用该方法分别对CSFV、PRRSV、JEV、SIV、PEDV、TGEV、GARV阳性模板及包含猪肠道病毒3 D基因和口蹄疫病毒3 D基因的重组质粒进行PCR检测,结果从以上9种常见猪病病原的阳性模板中均不能扩增出323bp大小的PCR产物,说明该检测方法的特异性很好,能够用作临床样品的检测。敏感性试验显示,本试验建立的检测方法能够检测到的模板最低质量浓度为180fg/mL。应用该方法对湖北省各大猪场进行了临床病料检测,在采集的165份病料中有118份样品检测为猪库布病毒阳性。在4个发生腹泻疫情的规模化猪场进行了分群抽样...

为了明确江苏新发生的矮缩病害为水稻黑条矮缩病,采用RT-PCR和序列测定方法对其病原进行了精确鉴定。根据水稻黑条矮缩病病毒基因组序列的信息,设计扩增RNA聚合酶基因、外壳蛋白基因和RNA沉默抑制子基因以及核心蛋白基因部分编码区的4对引物,提取感染水稻黑条矮缩病病毒的水稻植株总RNA并进行RT-PCR扩增,可以在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病病毒基因组特有的4个条带,测序结果表明,来源于江苏南京的分离物的4个基因部分编码片段与已登录的对应基因片段核苷酸序列同源性达99%以上,共发现7个碱基的突变。经生物信息学分析发现7个单碱基突变都是同义突变,氨基酸序列没有改变。根据以上结果确认该病病原为水...

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性...

【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）野毒株、猪A群轮状病毒（GARV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪阿尔法冠状病毒（SADS-CoV）及猪捷申病毒（PTV）5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析，以PEDV野毒株为模板，对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针，并在两端保守区域设计上下游引物；在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针，并加入简并碱基。同时，分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针，用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化；用RStudio参照代码绘制ROC曲线，确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC，并计算Youden指数，最终确定检测临界值；从阳性核酸中扩增靶基因，并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录，获得5种标准品分别命名为：cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估；并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为：35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL，标准曲线线性关系良好，扩增效率在96.3%—104%之间；该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、猪链球菌（S.suis）和葡萄球菌（S.aureus）等多种菌毒株均不检出，具有良好的特异性；经重复性检验，组内变异系数在0.22%—3.08%之间，组间变异系数在0.89%—4.0%之间；对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较，符合率分别为：PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外，对临床样本检测结果显示，当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出；但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行，其总体阳性率分别达到：10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242)，且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染，使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究，为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR，为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。