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[期刊] 林业科学
[作者]
段续伟 邓舒 沈元月 冯永庆 秦岭
利用RT-PCR与RACE扩增方法,分别从板栗正常雄花序和芽变短雄花序cDNA中分离出编码板栗天冬氨酸蛋白酶cDNA全长的序列,序列分析表明:克隆的cDNA片段总长分别为1 822 bp和1 909 bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小均为1 539 bp,可编码长度为513个氨基酸残基的蛋白质,所推导的蛋白质氨基酸序列与蓖麻、可可和葡萄的天冬氨酸蛋白酶的蛋白质氨基酸序列相似性分别为83%,80%和75%。正常与芽变短雄花序中天冬氨酸蛋白酶的氨基酸序列存在6个氨基酸的差异,其中有3个位于活性区。后证实分离出的2个天冬氨酸蛋白酶基因在正常雄花序和芽变短雄花序中共同存在,命名为CmAPs1和...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘裕峰 朱天辉 刘应高 谯天敏 李姝江 龙旭梅 韩珊
为深入研究板栗WRKY转录因子基因在板栗抗病过程中的分子作用机制,根据板栗转录组数据库分析获得EST序列,利用RT-PCR技术,克隆板栗WRKY转录因子cDNA(CmWRKY)序列,分析CmWRKY基因及其编码蛋白的相关信息并进行原核表达研究。结果表明,CmWRKY基因为1 437 bp,编码479个氨基酸,推测蛋白分子质量为52. 128 96 ku,理论等电点为9. 15,具有2个WRKY保守结构域和2个C2H_2锌指结构域,属于WRKY家族的第Ⅰ组,基因登录号为KY312850. 1。CmWRKY核苷酸序列与巴旦木等植物的WRKY基因一致性均在80%以上,与西班牙栓皮栎WRKY基因一致性最高,达到97%。同源建模表明,CmWRKY蛋白三级结构与拟南芥At WRKY1蛋白结构相似,推测其可能与At WRKY1具有相似的调控功能。分子进化分析显示,板栗CmWRKY与西班牙栓皮栎及核桃WRKY蛋白亲缘关系最近。SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,CmWRKY蛋白最佳诱导表达条件为0. 2 mmol/L IPTG在30℃下诱导10 h,蛋白分子质量为56 ku,其主要以可溶性蛋白的形式存在。为板栗CmWRKY基因的生物学功能研究及应用奠定基础。
[期刊] 林业科学
[作者]
唐征 杨凯 冯永庆 曹庆芹 沈元月 秦岭
利用RACE技术从板栗短雄花序突变体中扩增得到660bp的板栗脂质转运蛋白(lipid transfer protein,LTP)cDNA片段。该cDNA编码118个氨基酸,具有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及26个氨基酸的信号肽,它与棉花、草莓脂质转运蛋白氨基酸序列相似性为63%,基因序列已提交数据库(GenBank),其登录号分别为FJ490676(基因)和ACL01093(蛋白)。荧光定量分析表明板栗短雄花序突变体较正常雄花序的脂质转运蛋白表达量更高。将板栗脂质转运蛋白基因插入到硫氧还蛋白融合表达载体pET32a(+)中,构建了板栗的原核表达载体pET-LTP,在大肠杆菌菌株Roset...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
郭献平 李兴亮 段续伟 邓舒 曹庆芹 秦岭
为探明芽变雄花序赤霉素含量降低的分子机制,对板栗野生和芽变雄花序赤霉素合成关键酶基因古巴焦磷酸合成酶(CPS)、贝壳杉烯合成酶(KS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)、赤霉素20-氧化酶1(GA20ox1)和赤霉素3-氧化酶1(GA3ox1)的cDNA序列,以及KO基因DNA序列进行了比对,结果表明:两类花序中KO基因在开放阅读框的872、1 115和1 150bp存在3处碱基差异,分别造成了氨基酸由Glu、Tyr和Tyr突变为Gly、Phe和His,最终导致了跨膜区的改变,且发现cDNA上碱基突变是由DNA的碱基差异造成的。推测KO基因的这种突变导致板栗短雄花序性状。
关键词：
板栗 雄花序 贝壳杉烯氧化酶 碱基突变
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋杨 张艳敏 刘美艳 王传增 刘金 冯守千 王延玲 陈学森
【目的】克隆短枝型苹果(Malus domestica Borkh.)的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因:MdRGL1a/b、MdR...
[期刊] 华北农学报
[作者]
唐文芳 徐升胜 段延碧 龙雯虹 杨荣萍 张雪梅 孟金贵
为了克隆山药异戊烯基转移酶基因，预测该基因编码蛋白的结构和特性，并检测该基因在山药珠芽发芽期的表达特征，采用同源克隆的方法克隆山药IPT基因，使用生物信息学的方法预测蛋白质的序列和结构，通过实时荧光定量PCR检测基因的表达量。结果表明，在山药中克隆到了长为1 398,1 044,1 349 bp的3条核酸序列，依次命名为DoIPT1、DoIPT5a和DoIPT5b,基因登录号依次是：MW353160、MW353016、MW353017,各基因的阅读框长度依次为1 137,861,1 011 bp,编码氨基酸长度分别为378,286,336 aa。分析氨基酸生物信息得知，DoIPTs属于不稳定外在膜亲水性蛋白，DoIPT5b存在2个信号肽，其余无信号肽；3个蛋白的二级结构预测与三级结构模型图相符；DoIPTs的编码区与其他植物的异戊烯基转移酶蛋白高度同源。DoIPTs编码区域显示，DoIPTs N端含有P-loop NTPase结构域GXXGXGKS(T),具有催化形成细胞分裂素的能力。实时荧光定量PCR分析结果表明，在22℃无外界水条件下珠芽发芽时表皮中DoIPT5a的表达量最高，在潮湿环境下DoIPT1和DoIPT5b基因的表达量最高；多效唑处理能够使DoIPTs基因的表达上调。结果为进一步研究山药DoIPTs基因的功能奠定了基础。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
姜维 薛鹏 何永新 陈玉林
【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对Eda mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A...
[期刊] 水产学报
[作者]
杨国坤 徐双阳 梁晓敏 秦超彬 张艳敏 孟晓林 聂国兴
为研究GIP（葡萄糖依赖性肠促胰岛素，glucose-dependent insulinotropic polypeptide）在鲤体内的生理功能，实验利用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技术从鲤前肠克隆得到gip，对其进行生物信息学分析，并对其mRNA的表达进行检测。结果显示，鲤gip的开放阅读框（open reading frame，ORF）为324 bp，编码107个氨基酸。经过结构预测鲤Gip前体蛋白包括信号肽、N端结构域、Gip成熟肽和C端结构域。氨基酸序列比对及系统进化树分析结果显示，鲤Gip蛋白与斑马鱼Gip蛋白的亲缘关系最近。Real-time PCR结果显示，gip在鲤各个组织中均有表达，但在前肠和垂体组织表达量最高。葡萄糖灌喂实验结果表明，鲤的脑和前肠中gip的表达量在灌喂葡萄糖1和2 h后显著增加。在饥饿再投喂实验中，鲤前肠中gip的表达量在饥饿后显著降低，而再投喂后表达量显著升高。在饲养实验中，高糖和高脂均能显著增加鲤前肠中gip基因的表达量。本研究克隆了鲤gip，并且不同的营养状态可以调节其表达水平。研究结果可初步阐明Gip的生理功能，为探究Gip调节鱼类糖脂代谢的机制提供理论依据。
关键词：
鲤 Gip 鉴定 表达分析
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
马艳 朱馨蕾 杨长庚 张富春 尹伟伦
为深入研究胡杨的抗盐分子机制,并获得与之相关的抗逆基因,采用SMART技术构建了胡杨盐胁迫处理cDNA文库。经随机测序,得到一个编号为SSL061的EST序列,与欧美杨的脱水素基因有较高相似性,通过PCR快速扩增文库的方法获得了胡杨脱水素基因(Pedhn)。分析表明,该cDNA的长度为813 bp,拥有681 bp的开放读码框,共编码227个氨基酸。该序列包括两个重复的富含赖氨酸的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的S片段,但是缺乏Y片段。RT-PCR结果表明,胡杨在未受胁迫的情况下脱水素基因的转录水平较低,而随着盐胁迫浓度的升高,脱水素基因的转录水平总体呈上升趋势。
关键词：
胡杨 cDNA文库 脱水素 盐胁迫
[期刊] 林业科学研究
[作者]
暴帅 孔雪 邢磊 张翠霞 官民晓 赵丽红 刘闯 刘雪梅
白桦雄花发育周期较长,从出现雄花序至花粉成熟经历近一年,其发育早期和中期是决定雄配子体发育的重要时期。采用cDNA-AFLP方法对白桦早期和中期发育雄花序进行了差异表达谱分析,共得到了62个TDFs,其中30个TDFs与Genbank中的基因具有较高的同源性,其它32个是未知序列。GO分析结果显示,这些已知基因主要参与代谢过程、细胞过程、刺激应答、生殖、信号传导和生物调控等生物学过程,其分子功能主要涉及催化活性、结合分子功能、酶调节活性和转运活性等;发现了参与生殖和雄花发育的两个重要TDFs,Bplbs658和Bplbs199。另外,选择11个TDFs进行不同组织的qRT-PCR转录表达分析,...
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
吴琪 吴鸿飞 周敏舒 徐倩霞 杨丽媛 赵宏波 董彬
【目的】桂花Osmanthus fragrans是著名的香化植物,其花芽分化受到环境温度影响。研究环境温度对桂花花芽分化的影响对桂花的花期调控具有重要的指导意义。【方法】以桂花品种’堰虹桂’ O. fragrans ’Yanhonggui’为材料,采用石蜡切片观察其花芽分化进程,运用聚合酶链式反应和实时荧光定量技术对影响温度FCA(FLOWERING LOCUS CA)基因分别进行克隆及表达特异性分析。【结果】克隆得到OfFCA cDNA序列长为1 319 bp,其开放阅读框为864 bp,编码287个氨基酸。序列比对及进化分析发现:OfFCA与木犀科Oleaceae油橄榄Olea europaea和胡麻科Pedaliaceae芝麻Sesamum indicum的FCA相似度较高,同源性可达68%以上。在桂花花芽分化的不同时期,无论叶还是花芽中,19℃环境低温下OfFCA基因的表达水平均显著高于25℃常温生长条件下的表达水平。【结论】桂花OfFCA基因响应环境相对低温的变化,参与桂花的花芽分化,使桂花的花期提前。图6参23
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
杨兆辉 汪子洋 杨文涛 蔡瑜婷 谭伟龙 黄恩炯 张灵玲
乙酰化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,可参与多种细胞进程,但迄今未见有关乙酰化修饰在Bt中发挥作用的报道.本课题组前期通过对高效杀虫Bt菌株LLP29的基因组进行测序分析,发现该菌株也存在编码乙酰转移酶的基因(如ykkB).为探讨乙酰化修饰在Bt菌株中的作用,以ykkB为靶标,利用无缝克隆技术成功克隆与测序了ykkB基因.通过生物信息学分析,发现该基因编码的蛋白可能是一类N-乙酰转移酶,赖氨酸和亮氨酸含量最高,半胱氨酸含量最低,是一种亲水性蛋白质,且无跨膜区;同时,成功表达、纯化了YkkB蛋白,通过体外自乙酰化分析,证实该蛋白可发挥乙酰基转移的作用.
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘莉 孙虹丽 程召阳 贾兵 刘普 叶振风 朱立武 衡伟
为探索砀山酥梨褐皮芽变果皮褐色形成机理,试验以褐皮芽变果皮为材料,克隆了木质素生物合成相关的PAL2、4CL1、CAD1、PPO1、POD4等5个酶基因3'端序列,并利用Real-time PCR技术,分析各基因在花后25,50,75,100,125,150,175 d等不同时期的表达差异。结果表明,在基因相对表达量各取样时期,锈酥果皮中PAL2、4CL1、CAD1和POD4相对表达量均高于砀山酥梨。砀山酥梨果皮中木质素增量仅与POD4酶基因表达量存在极显著正相关性,而锈酥果皮中木质素增量与PAL2、4CL1、CAD1和POD4酶基因表达量均存在极显著正相关性。PAL2、4CL1、CAD1和P...
关键词：
梨 褐皮芽变 基因克隆 实时定量PCR
[期刊] 水产学报
[作者]
范美华 孙雪 王日昕 廖智 徐年军
实验以大型绿藻浒苔为材料,克隆了其抗氧化系统关键酶锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的部分片段,利用荧光定量PCR技术研究了Mn SOD和CAT对温度和水杨酸作用的响应规律。结果获得浒苔318 bp的Mn SOD基因,该Mn SOD推测的氨基酸序列与裂片石莼Mn SOD相似性最高为89%;获得了229 bp的CAT基因,该浒苔CAT编码氨基酸序列与裂片石莼和雨生红球藻CAT序列相似性分别为99%和93%。在利用M n SOD和CAT氨基酸序列构建的系统树中,浒苔均先与裂片石莼聚类,再与其他绿...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
隋娟 张志峰 邵明瑜 胡景杰
vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶,在生殖系分化过程中发挥着重要的作用。本研究采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从刺参(Apostichopus japonicus)精巢中克隆得到vasa的全长cDNA序列。该cDNA序列全长2167bp,开放阅读框1593bp,编码530个氨基酸,具有DEAD-box家族蛋白的全部9个保守域。经同源比对和系统进化分析,确定其属于DEAD-box家族的VASA亚家族成员。利用半定量RT-PCR检测,vasa mRNA专一性的在刺参性腺中表达,据此,刺参vasa基因有望用于其生殖系起源和分化的研究。
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