【目的】研究松材线虫Bxy-cul-1基因的表达特性和生物学功能，明确该基因在松材线虫生长发育中的作用，为从生长发育角度探索特异性的线虫种群增长控制措施提供理论基础。【方法】根据松材线虫基因组数据设计引物、克隆Bxy-cul-1基因，对Bxy-cul-1进行序列、系统发育和蛋白结构预测等生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术和原位杂交技术探究Bxy-cul-1基因在松材线虫各龄期的表达水平和表达部位，明确其时空动态表达特性，采用RNA干扰技术探究该基因在松材线虫生长发育中的作用。【结果】生物信息学分析结果显示，Bxy-cul-1基因CDS全长2 292 bp，编码763个氨基酸，属于Cullin蛋白家族。原位杂交结果表明，Bxy-cul-1基因在松材线虫各发育阶段均有表达，胚胎期全胚胎表达，2龄期广泛表达，3龄期和4龄期主要在肠道、体壁肌肉和尾部表达；成虫期，Bxy-cul-1基因在雌虫的卵母细胞和阴户、雄虫的腹部、交合刺和尾部表达。实时荧光定量PCR结果显示，Bxy-cul-1基因在松材线虫2龄期表达量最高，胚胎期次之，3龄期、4龄期、成虫期表达量依次递减。对松材线虫胚胎干扰后发现，松材线虫胚胎孵化率下降10.44%，未孵化出的胚胎大多停留在1龄末期，虫体腹部形成畸形肿大，不能突破卵壳；孵化出的部分2龄期幼虫也出现畸形性状，畸形虫无法正常伸展，中部食道腺异常膨大，尾部蜷缩。干扰2龄期幼虫，虫体活力下降明显，每30 s头摆频率约下降5次，部分2龄期幼虫也出现畸形性状，畸形虫体形短小，头部、食道腺异常膨大，尾部和腹部扭转在一起，虫体无法正常运动。发育进度试验结果表明，沉默Bxy-cul-1基因后，松材线虫发育进度减慢，干扰组2龄虫发育至成虫比对照组晚4天。【结论】松材线虫Bxy-cul-1基因是Cullin蛋白家族中的一员，基因表达水平及表达部位在不同发育阶段具有特异性。沉默该基因可使松材线虫胚胎的孵化率下降，且出现畸形性状，还会使松材线虫活力下降及发育进度减缓，表明Bxy-cul-1基因对松材线虫生长发育有着重要作用。

【目的】通过对热激转录因子基因Ｂｘ－ＨＳＦ－１的克隆和表达分析，为深入研究ｃ ＧＭＰ、ＴＧＦβ－ｌｉｋｅ和ｉｎＳｕｌｉｎ／ｉＧＦ等热激抗逆代谢路径提供理论基础。【方法】根据松材线虫基因组数据设计引物克隆松材线虫Ｂｘ－ＨＳＦ－１基因。进一步对Ｂｘ－ＨＳＦ－１进行Ｇｅｎｅ ＯｎＴＯｌＯＧｙ基因功能预测、系统发育分析、保守结构域分析等生物信息学分析。应用ＪＡＳＰＡＲ预测Ｂｘ－ＨＳＦ－１靶位点ＤｎＡ序列，根据松材线虫基因组数据筛选含有该序列的靶基因，并通过蛋白质三维结构分析和分子对接验证。应用荧光定量ｑ－ＰｃＲ检测Ｂｘ－ＨＳＦ－１及其靶基因在热激和低温处理条件下４个时间点的表达量，结合转录组数据对Ｂｘ．．．

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。

松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的严重病害,引起重大的经济和生态损失。钙调素(CaM)是真核生物中Ca2+主要传导蛋白,本研究采用RT-PCR方法,首次从马尾松中克隆获得CaM,命名为pmCaM,并检测了其响应松材线虫侵染的表达特征。序列分析表明:pmCaM完整的开放阅读框核苷酸序列为450bp,编码149个氨基酸的蛋白质;该蛋白含有4个EF-hand结构域,具有钙调素的典型特征,与其它植物的CaM蛋白均有较高同源性。实时荧光定量PCR分析显示:接种松材线虫后30 180 min时间段,马尾松苗根、茎、叶器官中的pmCaM均下调表达,但不同...

松材线虫取食和致病相关基因的鉴定是揭示松材线虫病致病机制的重要研究内容。以松材线虫混合虫体为测试方,线虫卵为驱动方,构建二者差减cDNA文库。文库测序结果经序列拼接、功能注释,共获得松材线虫虫体特异表达的有效EST序列354个,拼接后获得34个重叠群,其中15个重叠群获得明确的功能注释,其中MixC12、MixC25、MixC33分别与过氧化物酶、β-1,4内切葡聚糖酶、锌指家族蛋白有较高的同源性,这些基因被认为与植物线虫的取食和致病性密切相关。RT-PCR分析验证了所获得的差减cDNA的代表性。

【目的】类毒素过敏原蛋白(VAPs)是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。【方法】本研究利用聚合酶链式反应(PCR)扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。【结果】松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP_1和Bx-VAP_2基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP_3和Bx-VAP_4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21～31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体antiVAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP_4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,BxVAP_1潜在的优势B细胞抗原表位较多。【结论】重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3效价高,特异性良好,Bx-VAP_1具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。

【目的】通过测定松材线虫连续交配能力，分析虫龄和交配经验对松材线虫繁殖能力的影响，并研究松材线虫寿命对交配行为的响应，比较松材线虫雌雄虫生殖策略的差异性，明确松材线虫的交配特性，为从交配干扰角度找到控制松材线虫种群增长的切入点提供新的思路。【方法】获得同步发育的松材线虫处女雌虫和处子雄虫，通过连续跟踪观察，结合显微录像视频回放，分析松材线虫的连续交配能力。分别收集性成熟后第3天、第5天和第7天的松材线虫，以及不同交配经验的松材线虫，统计其交配成功率和产卵量，分析虫龄和交配经验对松材线虫繁殖能力的影响。同时，定量分析未交配和已交配松材线虫雌雄虫的寿命。【结果】处子雄虫在不取食的情况下，可以连续与3条处女雌虫成功交配并使其受孕产卵；而处女雌虫成功交配后先进行产卵，不会连续交配。对于未交配雌雄虫而言，交配成功率和平均产卵量均随着虫龄的增加而降低，交配成功率于性成熟后第7天达到差异显著水平，而平均产卵量于性成熟后第5天达到差异显著水平，且雌虫受虫龄的影响较雄虫更为显著。不同交配经验的松材线虫雌雄虫交配成功率存在显著差异，性成熟后第3天未交配雌雄虫的交配成功率分别为（60.00±9.43）%和100%，而相同虫龄已交配雌雄虫的交配成功率分别降至（17.50±4.68）%和（25.00±2.34）%，但其平均产卵量无显著差异。交配行为对松材线虫的寿命没有显著影响，未交配和已交配雌虫的平均寿命分别为（24.47±0.22） d和（24.93±0.70） d，未交配和已交配雄虫的平均寿命分别为（21.80±0.54） d和（23.43±0.78） d。【结论】松材线虫处子雄虫可以连续进行多次交配，而处女雌虫交配后会优先产卵。虫龄和交配经验均会显著影响松材线虫的交配成功率，但产卵量仅受虫龄影响。此外，交配行为不会加速松材线虫衰老。本研究明确了松材线虫的交配特性，为进一步探究其分子调控机制提供了理论基础。

为明确捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）中Kunitz型蛋白BLI-5的表达特性，利用生物信息学软件对其基因结构、保守结构域、进化关系和蛋白质三维结构进行分析；基于WormBase数据库，分析捻转血矛线虫发育过程各个阶段Hc-bli-5与Hc-bli-4的相对转录丰度；通过构建原核表达载体诱导表达重组蛋白，并制备多克隆抗体，采用虫体组织免疫荧光试验分析目标蛋白（Hc-BLI-5）在捻转血矛线虫中的组织定位情况。结果显示：1)Hc-bli-5基因全长2 088 bp，由4个外显子和3个内含子组成，Hc-BLI-5共有195个氨基酸，132～192位氨基酸为Kunitztype super family结构域，是一种丝氨酸蛋白酶抑制因子。2）进化树分析发现，丝氨酸枯草杆菌蛋白酶超家族蛋白BLI-5在寄生线虫和自由生活线虫中均有较为密切的进化关系，捻转血矛线虫与柏氏血矛线虫（Haemonchus placei）在该基因的进化关系上最为接近，聚集在进化树的同一小分支上。3）蛋白质结构对比分析显示，捻转血矛线虫和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）BLI-5具有一定的相似性，尤其是Kunitz结构域。4）各时期转录丰度检测显示，Hc-bli-5与Hc-bli-4的表达趋势有一定的重叠，提示二者可能互相作用、参与共同的生物学过程。5）组织定位研究表明，Hc-BLI-5蛋白主要表达于捻转血矛线虫的表皮和肌肉组织。综上，Hc-bli-5可能与Hc-bli-4相互作用参与捻转血矛线虫蜕皮过程。本研究明确了Hc-bli-5的序列特征及其蛋白的表达特性，为探索其是否参与捻转血矛线虫蜕皮过程及其作用机制提供了理论依据。

[目的]微小RNA(microRNA,miRNA)具有靶向沉默信使RNA(mRNA)表达的功能,是基因表达的负调控因子;研究并明确马尾松在遭受松材线虫侵染下是否存类似的调控模式,对于未来探析寄主植物对病原侵染胁迫下的应激机制及获得调控马尾松抗松材线虫病的miRNA及其靶标mRNA都具有重要意义。[方法]以前期高通量测序获得的松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松针叶mRNA和miRNA表达谱为研究对象,采用STEM软件分别分析mRNA和miRNA的表达变化模式,并运用斯皮尔曼等级相关法研究松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA与mRNA的表达关联情况。[结果]松材线虫侵染下的马尾松针叶中的miRNA呈2种显著的表达变化模式,mRNA呈8种显著的表达变化模式,且15个miRNA与其12个靶标mRNA的表达变化模式相反,符合miRNA对靶标mRNA的负调控特点,这些靶标mRNA编码具有识别病原作用的ACRE、CC-NBS-LRR基因等。[结论]松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA及mRNA均呈多种表达变化模式,且部分miRNA与靶标mRNA的表达变化模式相反,推测其中部分miRNA可能是病原识别基因的负调控因子。

【目的】通过对松材线虫效应因子基因的克隆和功能研究,揭示Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用,为防治松材线虫提供理论依据。【方法】用松材线虫Bx1022株系接种黑松,20 d后提取线虫总RNA进行转录组测序,将该转录组设为松材线虫植食阶段转录组。提取由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)培养的Bx1022的总RNA进行转录组测序,将该转录组设为菌食阶段转录组。比较分析两个转录组,筛选到差异表达基因Bx-Hh-grl。对Bx-Hh-grl编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽进行预测。利用原位杂交检测Bx-Hh-grl表达部位。应用RNAi技术干扰Bx-Hh-grl表达以探究Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用。通过Q-PCR验证,确定RNAi效果显著。将经RNAi处理的松材线虫接种3年生黑松枝条,以未经处理的松材线虫(CK组)和ddH2O(Mock组)处理的黑松作为对照,比较黑松发病情况进而比较不同处理后松材线虫的致病性差异。【结果】筛选出植食阶段与菌食阶段转录组差异表达基因Bx-Hh-grl,其编码蛋白质具有跨膜结构域和信号肽。原位杂交试验结果显示Bx-Hh-grl在松材线虫食道腺表达,符合效应因子基因特征。Q-PCR结果显示经RNAi处理后的松材线虫Bx-Hh-grl表达量下调,RNAi处理效果显著。接种实验表明,Bx-Hh-grl-RNAi组显症的时间明显晚于CK组,Mock组黑松一直保持健康状态。【结论】Bx-Hh-grl是与松材线虫致病相关的效应因子基因。明确Bx-Hh-grl功能有利于进一步了解松材线虫致病机理,为降低松材线虫危害,防治松材线虫奠定理论基础。

【目的】禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是一种严重危害麦类作物的重要植物病原线虫,对农业生产造成巨大的经济损失,然而其致病机制和有效防控方法还有待进一步研究。通过克隆禾谷孢囊线虫的果胶酸裂解酶新基因Ha-pel-1,并对其表达特性进行分析,为后续探究Ha-pel-1的基因功能及其与寄主的互作提供理论依据,并为探讨禾谷孢囊线虫防控途径提供新思路。【方法】采用同源克隆结合RACE技术从禾谷孢囊线虫中克隆出一个新的果胶酸裂解酶基因;采用DNAMAN、Clustal、Signal P 4.0 S

通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。

对目前松材线虫基因水平的研究进行了概述.目前已研究过的松材线虫基因主要分为三个方面:一是应用于检疫检验的研究,主要研究的基因有rRNA基因,利用rRNA的ITS区核苷酸序列进化速度较快的特点,能准确区分松材线虫与其近缘种;二是探讨致病机理的研究,主要研究了纤维素酶和果胶酸裂解酶等在食道腺细胞中表达的酶基因,发现纤维素酶基因可能是由于基因横跨作用从细菌迁移到松材线虫基因组内,有助于研究松材线虫致病性的起源;三是对松材线虫生长发育相关基因的研究,为控制松材线虫的生长发育提供了依据.

对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行改造,以获得密码子优化的抗虫基因,构建原核表达载体后,将重组载体转入大肠杆菌进行诱导表达并对诱导蛋白进行抗虫试验。首先根据植物密码子的偏好性及使用频率,优化、改造并人工合成了Cry1Ab基因,序列分析表明:改造后的Cry1Ab基因全长1 848 bp,与原始序列同源性为66%,G+C含量由原来的37.34%提高到63.04%。将改造后的Cry1Ab基因与原核表达载体p ET28b(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性菌液进行诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示:Cry1Ab蛋白在BL21(DE3)细胞中得到高效表达,分子量为7...

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)响应H_2O_2胁迫的分子机制,利用荧光定量PCR测定松材线虫过氧化物还原酶基因BxPrx在不同浓度(2.5、5.0、7.5、10.0mmol/L)H_2O_2胁迫下的转录水平;利用RNA干扰技术,沉默松材线虫BxPrx基因,比较H_2O_2胁迫下BxPrx基因沉默组与非基因沉默组松材线虫存活率的差异。结果显示:松材线虫的存活率与H_2O_2胁迫浓度呈负相关;松材线虫BxPrx在H_2O_2胁迫下的转录水平均提高;在5.0、7.5、10.0 mmol/L H_2O_2胁迫下,经过BxPrx基因沉默处理的松材线虫存活率显著低于对照组。