将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5'-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3'),反向引物为M05R1(5'-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3'),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行...

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA(RAPD)和特征序列扩增区域(SCAR)标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5′-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3′,下游引物:5′-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3′),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段。该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来。在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出...

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明:1)运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860bp特异条带,第1、5、6号样品与9号拟松材线虫、10号大核滑刃线虫均未出现扩增谱带,表明第2、3、4、7号4个待测样品中含有松材线虫,而第1、5、6号3个待测样品中不含有松材线虫;2)运用实时PCR检测,第2、3、4、7号4个样品与8号松材线虫样品表现有明显的阳性扩增信号,其余样...

为了获取准确、快速检测松材线虫的方法,利用纤维素酶活性、苯乙酸与苯甲酸含量和显色剂检测松材线虫的方法进行了比较研究.纤维素酶活性检测结果为病树与健树酶活性差异显著.病树的光吸收值与健树的光吸收值差异不显著,但测定结果不稳定.显色剂测定病树内与健树内的显色差异明显,病树的显色结果呈深红色至浅红色,线虫愈多色泽愈深;健康材呈无色,感染拟松材线虫的松材呈清白色或无色.显色剂检测是简单、快速和有应用价值的方法.

【目的】玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫，可侵染多种禾本科作物的根部，玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系，以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫，为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫；选取13条含有10个碱基的随机引物，采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析，筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段，并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物；采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】通过RAPD比对分析，发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段；将该片段回收测序，根据片段序列信息，利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1；特异性检测结果表明，HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段，其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带；以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时，特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段，而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段；该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的；对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试，表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力，检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术，可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测，对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力，检测引物特异性强，检测方法便捷稳定，灵敏度高。

本研究采用种子聚合法合成聚苯乙烯磁性微球,并以兔抗松材线虫IgG致敏,制备出能特异性地捕获松材线虫蛋白抗原的免疫磁性微球。以生物素标记抗体为示踪抗体,并结合酶标亲和素检测系统,用于疫木样品的分析。利用该方法对采自不同地区的3种松树,其中松材线虫病木17株、拟松材线虫病木5株和健木3株进行检测。实验结果表明,虽然拟松材线虫病木也呈现了一定的交叉反应,但疫木中松材线虫总检出率为94.1%,灵敏度达到0.1μg.mL-1线虫蛋白抗原。研究表明免疫磁性捕获ELISA技术可直接捕获木屑中的微量线虫抗原,具有简便、快速、准确等优点,是一种实用的松材线虫的快速检疫方法。

松材线虫Bursaphelenchusxylophilus早期诊断是防治松材线虫病的重要环节。为了在早期快速测定寄主(松树)体内的病原线虫,开发了便携式显微镜和松枝解剖技术。用修枝剪采集松枝,用解剖刀进行松枝切片,再用便携式显微镜镜检,结果显示松枝内松材线虫检出率为70%,其中濒死松树内检出率为100%,局部枯枝内检出率为60%,健康枝内检出率为0。野外松林内鉴定一个样本平均用时2.5min。使携式显微镜加枝条解剖法能对松材线虫病实施早期快速诊断。表3参25

以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径

【目的】建立松材线虫微滴式数字PCR检测体系，验证该检测体系的有效性，为松材线虫检测提供一个更精确灵敏的定性检测方法。【方法】基于松材线虫16S rDNA基因序列，使用在线工具设计特异性引物和探针。优化PCR反应条件，明确微滴式数字PCR的最佳反应条件。再以采集自不同地区的6株松材线虫和12株拟松材线虫、滑刃线虫、伞滑刃线虫、垫刃线虫的基因组DNA溶液为模板对该体系的特异性进行检测；以稀释10倍的标准DNA为模板，设置不同浓度梯度来验证该体系的灵敏度；以3个不同浓度的DNA标准品稀释模板检测微滴式数字PCR的可重复性。最后以人工模拟添加线虫样品和感病松木样品DNA提取液为模板对该体系的实用性进行验证。【结果】1）设计了松材线虫特异性引物探针一组，引物：P1904-F、P2057-R；探针：Probe-1938。2）PCR反应体系经优化，确定其最佳退火温度为55 ℃。3）特异性验证表明，设计的引物探针可以将松材线虫与其他相近种的线虫区分开。4）灵敏度检测结果发现，该检测体系的检出浓度在0.51～20 000 copies/μL。5）对3组不同浓度标准样品的可重复性检测发现，该检测体系的变异系数在0.31%～9.12%之间，并且样品浓度与变异系数呈负相关。6）使用该检测体系检测林间感病松木样品和人工模拟加入松材线虫的样品发现，该检测体系能够特异地检测出样品中的松材线虫，且拷贝数与样品中的线虫量呈正向相关。【结论】本研究建立了松材线虫微滴式数字PCR检测体系，该方法特异性好，检测灵敏度高，变异系数小，可高效地检测出样品中的松材线虫。该体系的建立可为松材线虫病理学和生态学研究提供可靠的研究数据。

【目的】针对无人机松林图像中早期松材线虫病害特征不明显、尺度多变导致的目标漏检、误检问题，提出一种基于深度学习的早期松材线虫病害检测方法。【方法】首先，为了便于在无人机机载端的模型部署需求，提出一种降低计算量和参数量的松材线虫病害检测方法；其次，为获取早期松材线虫病害更准确的特征，采用多种方式同时提取特征并融合以增强对有效特征的学习能力；然后，为进一步提高不同尺度特征的融合能力，使用注意力机制对齐相邻两级特征；最后，以辽宁抚顺大伙房试验林场无人机拍摄的早期松材线虫病害为研究对象，利用LablImg开源软件标注拍摄高度为100～240 m的图像，构建无人机早期松材线虫病害图像（EPI）数据集。【结果】在EPI数据集上的测试结果表明，本研究方法的平均精度（AP）最高达95.2%，相比YOLOv5s、YOLOX-s和YOLOv6s的AP分别提高3.1%、4%和0.9%；该模型体积仅12.8MB，分别是YOLOv5s、YOLOX-s和YOLOv6s模型体积的23.6%、17.8%和8.9%。【结论】本研究方法具有较高识别精度，同时保持模型体积较小，可为无人机在机载端识别早期松材线虫病害提供可能。

以松材线虫rDNA -ITS2为靶区 ,建立松材线虫的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。对松材线虫大量DNA和单条线虫的检测结果表明 ,探针检测松材线虫和拟松材线虫时 ,前者产生明显的荧光信号 ,后者无荧光信号 ,表明探针具有高度的特异性 ;探针检测到最低模板浓度为 1pg·μL- 1 ,DNA测序结果与实时荧光PCR结果一致

【目的】对受松材线虫病影响的树木进行快速、高效和精确的检测。【方法】利用深度学习技术中的YOLO v4(you only look once version 4)目标检测模型，对高分辨率影像中的松材线虫病变色木进行检测，并与SSD(single shot multibox detector)模型进行对比。【结果】YOLO v4模型的检测精度较高，精确度(P)为0.961 3,召回率(R)为0.764 9,F1分数为0.851 9。【结论】YOLO v4可准确地识别和定位松材线虫病变色木，且精确度比SSD高。

【目的】从日本五针松(Pinus parviflora)栽培圃地调查松褐天牛(Monochumus alternatus),并取样镜检松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus),揭示日本五针松感染松材线虫病的可能性和扩散风险,为开展检疫提供理论依据。【方法】在日本五针松圃地采集枯死或濒死的日本五针松植株,采用分离镜检法检测枯死或濒死日本五针松木质部的线虫种类;剖木检查天牛危害,观察留在日本五针松松枝上的补充营养伤口,同时鉴定天牛幼虫特征,解剖检验羽化的天牛成虫携带LⅣ状态。【结果】在

【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫DNA的方法。【方法】运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫DNA的方法,并通过普通PCR与环介导等温扩增(LAMP)对提取的DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫DNA的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%(W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的CTAB法和蛋白酶K法比较,Chelex-100法提取的DNA得率高,相同条件...