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[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
张克云 张崇星 吕毅 徐春花 王旭 林茂松
应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg2+浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响,旨在建立松材线虫的最佳反应体系,并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明:37℃的复性温度、3.0 mmol.L-1Mg2+、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1~25 ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系,通过对100个随机引物的分析,获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
赵鹏 Keith E.Woeste 张存旭 程飞 张硕新 蔡靖
核桃属种质资源丰富,其中多数物种木材材质优良,果实可食,营养丰富,为重要的经济树种。以美国白核桃Juglans cinerea、日本核桃Juglans ailantifolia等为材料,通过改良CTAB方法,从嫩芽、新鲜叶片和干叶片中分别提取核桃基因组DNA,并以此DNA为模板对RAPD-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果表明,改良的CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染,大大提高DNA的数量和质量。优化适合于美国核桃、日本核桃和杂合核桃的RAPD-PCR反应体系为:在20μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg/mL牛血清蛋白(B...
关键词：
美国白核桃 日本核桃 RAPD 优化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
苏宇 于海英 赵冰峰 蒋欢 唐贵婷 张勇 吴朝君 王旭祎
【目的】建立松材线虫微滴式数字PCR检测体系，验证该检测体系的有效性，为松材线虫检测提供一个更精确灵敏的定性检测方法。【方法】基于松材线虫16S rDNA基因序列，使用在线工具设计特异性引物和探针。优化PCR反应条件，明确微滴式数字PCR的最佳反应条件。再以采集自不同地区的6株松材线虫和12株拟松材线虫、滑刃线虫、伞滑刃线虫、垫刃线虫的基因组DNA溶液为模板对该体系的特异性进行检测；以稀释10倍的标准DNA为模板，设置不同浓度梯度来验证该体系的灵敏度；以3个不同浓度的DNA标准品稀释模板检测微滴式数字PCR的可重复性。最后以人工模拟添加线虫样品和感病松木样品DNA提取液为模板对该体系的实用性进行验证。【结果】1）设计了松材线虫特异性引物探针一组，引物：P1904-F、P2057-R；探针：Probe-1938。2）PCR反应体系经优化，确定其最佳退火温度为55 ℃。3）特异性验证表明，设计的引物探针可以将松材线虫与其他相近种的线虫区分开。4）灵敏度检测结果发现，该检测体系的检出浓度在0.51～20 000 copies/μL。5）对3组不同浓度标准样品的可重复性检测发现，该检测体系的变异系数在0.31%～9.12%之间，并且样品浓度与变异系数呈负相关。6）使用该检测体系检测林间感病松木样品和人工模拟加入松材线虫的样品发现，该检测体系能够特异地检测出样品中的松材线虫，且拷贝数与样品中的线虫量呈正向相关。【结论】本研究建立了松材线虫微滴式数字PCR检测体系，该方法特异性好，检测灵敏度高，变异系数小，可高效地检测出样品中的松材线虫。该体系的建立可为松材线虫病理学和生态学研究提供可靠的研究数据。
[期刊] 林业科学研究
[作者]
张路平 孔繁瑶 杨宝君
对松材线虫 7个株系和拟松材线虫 2个株系的线粒体DNA随机扩增多态性分析结果显示 ,松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的变异性 ,但种间变异明显大于种内变异 ,因而支持将松材线虫和拟松材线虫划分为两个不同的种。两个拟松材线虫株系 (法国株系和日本株系 )之间的相似值和松材线虫各株系间的相似值极为接近 ,由此看来 ,这两个株系的变异为种内变异 ,应同属于一个种。聚类分析的结果表明 ,松材线虫和拟松材线虫系两个明显不同的类群 ,即松材线虫类群和拟松材线虫类群。松材线虫类群又分为两个亚组 ,一个是以日本株系为代表 ,另一个是以北美洲 (美国和加拿大 )株系为代表
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张冬梅 杨娅 沈熙环 茹广欣
油松是我国特有的重要乡土针叶树种,开发合适的油松PCR-SSR引物并建立优化的反应体系,是开展油松天然群体和种子园人工群体遗传研究的基础.该研究以油松总DNA为材料,分析了Taq聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对PCR-SSR扩增结果的影响,筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物12对,建立了稳定的、可重复的油松PCR-SSR最佳反应体系及PCR扩增参数.研究结果表明:在15μL SSR-PCR反应体系中,样本最适宜浓度为30 ng,Mg2+的最适浓度为0.25 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为250 nmol/L;Taq聚...
关键词：
油松 SSR标记 引物 反应体系 优化
[期刊] 西南农业学报
[作者]
任鹏鸿 韩睿 马胜超 李莉
本研究通过单因子优化试验和L16(45)正交试验设计的方法,对菊芋SSR-PCR反应体系进行优化。结果表明,20μl最佳反应体系:10×PCR扩增缓冲液,2.5 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L dNTPs,0.30μmol/L正反引物,0.2 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。利用该优化体系,从100个SSR引物组合中筛选出12个清晰且多态性高的引物组合对3个品种的菊芋DNA序列进行扩增,得到58个位点,其中多态性位点39个,多态率为67.2%;建立3个菊芋品种分子识别卡,用2对引物组合的6个多态性位点即可将其分开。本研究为后续应用SSR分子标记技术对菊芋进行种质...
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
胡尚力 徐刚标 梁艳 刘雄盛 肖玉菲 郝博搏
伯乐树为国家一级保护植物,在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。cpDNA-PCR反应是在分子水平上确定伯乐树系统分类的基础。建立了伯乐树cpDNA-PCR反应体系,对影响扩增反应的因素(Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度以及模板DNA浓度)进行了优化,得到了伯乐树cpDNA-PCR扩增反应的最佳体系,并筛选出了适合伯乐树分子谱系地理研究的非编码区序列和引物。伯乐树cpDNA-PCR最佳反应体系为:30μL反应体系含有10×PCR buffer、2.9 mmol Mg2+、120 mmol dNTP、上下游引物各11μmol、DNA模版30 ng以及3个单位的Ta...
[期刊] 林业科学研究
[作者]
王芳 廖柏勇 李培 刘明骞 李俊成 吴琳瑛 林玮 陈晓阳
［目的］借鉴以往楝属文献报道的ＳＳＲ引物，筛选高度多态性、稳定性高、重复性好的苦楝ＳＳＲ引物，为苦楝遗传图谱构建、ＱＴＬ定位和分子标记辅助选择育种等研究领域应用奠定基础。［方法］本研究采用单因素法和正交试验设计进行ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化，并利用该体系以８个不同种源的苦楝基因组ＤＮＡ为模板，从１３５对候选ＳＳＲ引物中进行引物筛选。［结果］苦楝ＳＳＲ－ＰＣＲ最优反应体系为：１．０μＬ ５０ Ｎｇ·μＬ～（－１）模板ＤＮＡ，１．２μＬ １００μｍｏＬ·Ｌ～（－１）引物，１．０μＬ １０ ｍｍｏＬ·Ｌ～（－１）Ｄ ＮＴＰＳ，０．８μＬ ２５ ｍｍｏＬ·Ｌ～（－１）ｍｇ～（２＋），０．１５μＬ ５ ．．．
关键词：
苦楝 SSR-PCR 体系优化 引物筛选
[期刊] 中南林业科技大学学报
[作者]
黄芳芳 何长青 闫丽君 汪灵丹 徐刚标
在单因素试验基础上,采用正交试验优化影响观光木SSR-PCR扩增的5种主要影响因素,获得最佳反应体系(10μL)为:Mg2+1.0 mmol,d NTP 0.20 mmol,引物0.25μmol,Taq DNA聚合酶0.75 U,模板DNA 60ng。利用优化SSR-PCR扩增体系,从12对引物中筛选出5对多态性高、重复性好的引物。这为进一步开展观光木种群遗传多样性研究奠定了前期实验基础。
关键词：
观光木 SSR 体系优化 引物筛选
[期刊] 华北农学报
[作者]
苏辉 李志刚 宋书宏
以大豆(Glycine maxL.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量。以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响。大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0μL10×PCRBuffer,30 ng模板DNA,150μmol/LdNTP,0.4μmol/LSSR引物,1.5 UTaqDNA聚合酶,2.0 mmol/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL...
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
崔思佳 王水南 丁中 彭德良 黄文坤
采用正交设计对旱稻孢囊线虫ＩＳＳＲ–ＰＣＲ反应体系的４因素（Ｔａｑ酶、模板ＤＮａ、Ｄ ＮＴＰＳ、引物）在４个用量水平上进行优化试验。结果表明，旱稻孢囊线虫ＩＳＳＲ–ＰＣＲ最佳的反应体系为：在２５μＬ反应体系中，含Ｔａｑ ＤＮａ聚合酶（５ Ｕ／μＬ）０．３μＬ﹑模板ＤＮａ １μＬ﹑Ｄ ＮＴＰＳ（２．５ ｍｍｏＬ／Ｌ）２μＬ﹑引物（１０μｍｏＬ／Ｌ）１μＬ﹑１０×ＰＣＲ ＢＵｆｆｅＲ（２０ ｍｍｏＬ／Ｌ ｍｇ２＋ＰＬＵＳ）２．５μＬ。引物ＵＢＣ８８７最适退火温度为４８℃。优化的旱稻孢囊线虫ＩＳＳＲ–ＰＣＲ的反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
王燕 龚义勤 赵统敏 刘广 郁樊敏 叶海龙 柳李旺
对番茄基因组DNA的SRAP-PCR体系中Mg2+、dNTPs和引物浓度进行了优化,结果表明反应体系中适宜浓度为Mg2+1.5~3.0 mmol.L-1,dNTPs 0.05~0.20 mmol.L-1,引物0.25μmol.L-1;模板DNA为10~20 ng(10μL反应体系)。运用优化的体系,筛选获得3个合作906与其父母本多态性标记引物组合。利用15个引物组合对11个番茄主要品种以及1个近缘野生种进行种质鉴定的SRAP标记分析,10个多态性的引物组合共检测到55个多态性位点,平均每个引物可鉴别3.7个品种,双引物组合m e8/em8-1与m e6-1/em14-1可以区分所有供试材料。...
关键词：
番茄 SRAP 体系优化 品种鉴定
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
陶金 乔光 文晓鹏 刘涛 彭志军
基于火龙果Ty1-copia类反转录转座子的长末端重复序列信息设计引物,采用5因素4水平L16(45)的完全随机正交试验,对Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和DNA含量进行优化,建立火龙果IRAP分子标记反应体系。结果表明,25μL反应体系含基因组DNA 20ng、2.5mmol/L MgCl2、0.10mmol/L dNTPs、10×PCR Buffer 2.5μL、Taq DNA聚合酶0.75U、0.25μmol/L LTR引物,0.080g/mL的非变性PAGE胶适于IRAP多态性检测。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
汪成成 崔文山 董健 冯健 王骞春 姜韬 闫文文 张璐
利用正交设计L16(45)对日本落叶松SRAP-PCR反应体系的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶浓度五因素在四个水平上进行优化试验,PCR结果采用统计软件SPSS13.0进行分析,结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中模板DNA影响最大;筛选得到日本落叶松SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为模板DNA浓度为120ng.20μL-1,dNTPs的浓度为0.15mmol·L-1,引物浓度为0.3μmol·L-1,Mg2+浓度为1.5mmol·L-1,Taq酶浓度为0.5U.20μL-1。这一优化体系的建立为今后利用SRAP标记技术对日本落叶松遗传多样...
关键词：
正交设计 SRAP-PCR 日本落叶松
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
张媛 胡则辉 周志刚 陈亚瞿
利用RAPD-PCR及ISSR-PCR两种分子标记技术对长江出海口两年3个群体的52条刀鲚(Coiliaectenes)进行群体遗传结构的分析。在3个群体中,利用RAPD-PCR标记技术,15个10 bp随机引物共检测到110条带,多态性为0.490~0.657,Shannon多样性指数为18.63~22.38,Nei平均遗传距离为0.1195~0.1454;而利用11个ISSR引物所获得的相应结果分别为67、0.576~0.682、11.56~13.66以及0.117~0.147。相关性分析表明这两种技术所获得的上述数据呈正相关(r=0.95,P<0.05)。AMOVA结果显示,3个群体按采...
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