【目的】探究松材线虫对药物敏感能力产生的分子机制,为防治松材线虫提供理论基础。【方法】本研究从松材线虫基因组中获得秀丽线虫同源解毒基因Bx-pgp23,并对该基因蛋白编码区进行PCR扩增,随后通过生物信息学对蛋白质Bx-PGP23理化性质、亲疏水性、跨膜区分布、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行了分析和预测。并通过RNAi技术对Bx-pgp23进行沉默处理,分析Bx-pgp23沉默与否对松材线虫药物敏感程度的影响。【结果】生物信息预测结果显示PGP蛋白稳定系数为38.31,亲水系数为-0.018,三级结构预测PGP蛋白具有多个氨基酸参与构成α螺旋和β折叠并且具有多个核苷酸结合域和跨膜结构域。应用RNAi技术对Bx-pgp23基因进行基因沉默,沉默后的Bx-pgp23基因表达量变为原来的42.65%。药剂敏感性检测实验结果显示,在1.5和2.5 g/L苦参碱溶液处理24 h后,RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高了7.2%和6.4%,在1.5和2.5 g/L的苦参碱溶液处理48 h后,RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高9.0%和7.2%。【结论】蛋白质Bx-PGP23是一种稳定的亲水蛋白,具有跨膜外排功能。成功克隆Bx-pgp23基因并合成了该基因dsRNA。Bx-pgp23基因沉默影响了松材线虫对苦参碱的敏感性,在相同质量浓度的苦参碱胁迫下,RNAi组线虫死亡率明显高于对照组,说明Bx-pgp23基因在松材线虫药物代谢调控中发挥着正向调控作用。

为筛选出对松材线虫Bursaphelenchus xylophilus具有高效快速杀灭作用的药物,采用线虫悬浮液+农药的直接触杀法,选择了22种药物处理松材线虫1 h,测定了对松材线虫的半致死浓度(LC50)。结果表明:不同药物对松材线虫表现出不同的杀灭作用,供试的22种药物中,甲基阿维菌素(甲维盐)杀灭效果最好,1 h半致死浓度仅为0.3 mg.L-1;杀螟丹效果最差,1 h半致死浓度达21 053 mg.L-1。另外,苦参碱、抑太保、溴氰菊酯和阿维菌素等4种药物对松材线虫具有很强的毒杀作用,其1 h半致死浓度分别为1.2,2.5,4.2和4.5 mg.L-1。甲维盐和阿维菌素能高效快速杀灭...

为从药物酶的角度建立一种客观评价鱼类"首过效应"的方法,利用荧光定量PCR法测定尼罗罗非鱼(Oreochomis niloticus Linn)肝、肾组织中P-糖蛋白(P-gp)基因表达量,分析了单剂量(40 mg.kg 1)口服给药恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)后,尼罗罗非鱼肠道、肝组织中mRNA水平的相对表达量与ENR血药浓度的时实相关性。实验结果显示:在尼罗罗非鱼肠道、肝组织中,P-gp基因在分子量127 bp处出现了与预期大小相符的特异性扩增片段。对尼罗罗非鱼口灌给药ENR后,ENR能迅速通过肠道进入血浆,其在肠道、肝和血浆中的消除速度较快,其药物时量曲线关系符合一级吸收...

[目的]P-糖蛋白(P-gp)是影响底物药物口服生物利用度至关重要的因素。本试验旨在探究脂多糖(LPS)对猪肝脏、肾脏和小肠组织中P-gp定位和表达的影响,为临床合理有效用药提供理论支持。[方法]采用免疫组织化学SABC法结合DAB显色技术,用抗P-gp的单抗C219对相关组织的P-gp进行定位,进一步采用Image-ProPlus软件对猪肝脏、肾脏、空肠和回肠中P-gp的表达进行半定量分析,检测LPS处理对P-糖蛋白定位和表达的影响。[结果]猪肝脏组织中的P-gp均主要分布于肝细胞间的胆小管细胞膜上,LPS处理3h后P-gp表达量显著上升(P<0.05),6h后可降至正常水平。猪肾脏中P-g...

用DEAE-52阴离子交换柱提取、纯化牡蛎糖蛋白,分离纯化的牡蛎糖蛋白命名为糖蛋白GⅠ,糖蛋白GⅡ。用葡聚糖凝胶柱层析分别分析纯化糖蛋白GⅠ,糖蛋白GⅡ,结果表明:牡蛎糖蛋白GⅠ中分离出1种糖蛋白组分GⅠ-1;牡蛎糖蛋白GⅡ纯化出4种糖蛋白组分(GⅡ-1,GⅡ-2,GⅡ-3,GⅡ-4),GⅠ-1为未经洗脱的透过峰,该组分可能是糖蛋白凝聚体,由凝胶电泳分析估算得知GⅠ-1,GⅡ-1,GⅡ-2,GⅡ-3的分子量分别为42.5kDa,100.0kDa,55.3kDa,41.4kDa。

【目的】分析低温诱导下朵丽蝶兰(Doritaenopsis hybrid)叶片的营养生长特性以及碳水化合物的含量与相关基因表达模式的变化规律,为明确低温对朵丽蝶兰花梗抽出的生理生化机制奠定基础。【方法】对朵丽蝶兰进行高温(30℃/25℃)和低温(22℃/18℃)处理,测定其叶片的生长和叶绿素荧光,以及碳水化合物含量的变化,同时对朵丽蝶兰"温敏"SSH文库中分离的两个糖转运蛋白基因(片段)在相对低温处理下的表达特性进行分析。【结果】经过22℃/18℃(昼/夜)的低温处理29—36 d,98%的植株抽出花梗,并在以后的培养中(3个月)陆续开花。而高温对照组无植株开花。整个低温处理阶段中,朵丽蝶兰叶...

利用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100对来源于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)ZC13菌株97-151a菌丝细胞壁的糖蛋白激发子CSBⅠ进行纯化过程的优化。离子交换层析条件的选择结果表明:弱阴离子柱DE-AE-Sepharose FF和Tris-HCl缓冲体系的洗脱效果较好。新的步骤是:选用YM30膜超滤,省略ConA-Sepha-rose 4B亲和层析,粗激发子过凝胶柱Sephacryl S-100,阴离子柱DEAE-Sepharose FF,获得的活性峰D3,即为纯化的CSBⅠ。随着激发子的逐步纯化,其诱导不同水稻品系叶片中的POD比活相应显著升高(P<0.01)...

【目的】类毒素过敏原蛋白(VAPs)是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应,从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析,明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能,为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。【方法】本研究利用聚合酶链式反应(PCR)扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因,通过实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时,将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体,构建重组质粒pET-32b-VAPs,经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠,4次免疫后获得多克隆抗体;采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价;利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行蛋白鉴定。最后,应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性,预测B细胞抗原表位。【结果】松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异,其中Bx-VAP_1和Bx-VAP_2基因在成虫期表达量较高,Bx-VAP_3和Bx-VAP_4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21～31 kDa之间,纯化后的多克隆抗体antiVAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性,但anti-VAP_4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽,具有SCP结构域,无跨膜结构域,BxVAP_1潜在的优势B细胞抗原表位较多。【结论】重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致,均为包涵体表达,制备的多克隆抗体anti-VAP_1、anti-VAP_2和anti-VAP_3效价高,特异性良好,Bx-VAP_1具有潜在的B细胞抗原表位优势,为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。

【目的】为提高苦参碱的杀虫效果,对松材线虫的药剂防治靶标乙酰胆碱酯酶1基因(Bx ACE1)进行研究。【方法】松材线虫采集自广东省内马尾松,贝曼漏斗法分离,灰葡萄孢菌苔上25℃避光培养扩繁线虫。克隆Bx ACE1基因全长并进行序列分析,通过基因沉默和蛋白抑制2种技术阻断该基因功能,研究苦参碱的杀虫效果,并应用Q-PCR技术鉴定RNAi效果。【结果】5'和3'序列拼接得到基因全长2 145 bp,命名为Bx ACE1。同源序列多序列比对表明线虫ACE的进化速度与线虫进化速度一致。蛋白质三维结构分析表明,Bx ACE1由14个α螺旋包围着13个β折叠,鉴于氢键数量越多结合越稳定,利用docking...

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。

以脱脂松仁粕为材料,清蛋白提取率为考察指标,蒸馏水为提取剂,设料(质量,g)液(体积,mL)比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取温度(35、40、45、50、55℃)和提取时间(30、60、90、120、150 min)3个单因素试验,在单因素试验的基础上采用响应面法优化清蛋白的提取工艺,并对清蛋白的功能性质进行研究。结果表明:松仁粕中清蛋白的最佳提取工艺为料液比1∶25、提取时间92 min、提取温度53℃,松仁粕中清蛋白的提取率可达23.52%;松仁粕清蛋白的溶解度在pH值为3

体外培养后分离出的3个伊氏锥虫变异群体,经环磷酰胺处理大鼠(CY 大鼠)扩增收虫。虫体纯化后超声波裂解,超速离心制成可溶性抗原,经 Sephadex G-50脱盐和 DE-52离子交换层析提纯可变表面糖蛋白(VSG)。经 SDS-PAGE 鉴定,所提纯的3个 VSG 分子量均为40500。用日立835-50型高速氨基酸组成分析仪分析,3个 VSG 均由 Asp,Pro,Thr,Ser,Glu,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,Arg共17种氨基酸组成,但在组成比例上差异明显,尤其表现在 Pro,Met,Leu,Ile.Tyr 和 Clu。经...

锥虫的抗原变异非常频繁,阻碍了免疫学防治技术的建立,国内外虽然对此有较多研究报告,但对中国不同地理、宿主株伊氏锥虫表面变异糖蛋白(VSG)分离和特性比较尚无报道,而我国北方新疆骆驼株伊氏锥虫和南方牛、马伊氏锥虫存在来源、地理、宿主和生化特性的差异,因此我们对这两个虫株的 VSG 进行了分离、纯化和特性比较研究,所用虫株来源于新疆骆驼体内、安徽水牛体内.分离后克隆为单一虫株,经小白鼠、大白鼠体内繁殖,鼠血经过 DEAE-52纤维素层析获得纯净锥虫,再经超声裂解,经过两次超速

为提高花生蛋白质的功能特性,以花生(Arachis hypogaea L.)品种‘百日红’为原料,提取不同发芽阶段的分离蛋白,以未处理样品为对照,研究其功能特性的变化。结果表明:不同发芽阶段提取的花生分离蛋白的化学成分不同,随着发芽时间的延长,粗脂肪和总糖含量下降,而蛋白质和水分的含量无显著变化。发芽可以提高花生蛋白质溶解度,尤其是在pH值4~6范围内变化显著(P

对舟山海岛松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus发生前设置的7个典型松林样地进行复查。结果表明:通过17a的自然恢复,舟山海岛松材线虫病除治迹地已演替到针阔混交林或阔叶林阶段,其乔木层的多样性有所增加,增加幅度顺序为:演替到落叶阔叶林和常绿落叶阔叶混交林的马尾松Pinus massoniana纯林>演替到落叶阔叶林的黑松P.thunbergii纯林>演替到针阔混交林的马尾松纯林>演替到落叶阔叶林的黑松阔叶树混交林>演替到常绿落叶阔叶混交林的马尾松阔叶树混交林。马尾松阔叶树混交林更新层和灌木层的多样性下降,原更新树种极少的黑松纯林更新层多样性上升,其他林分的更新层和灌木层...