【目的】对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢胞外分泌复合体亚基CcExo70进行功能分析,探究其在杨树腐烂病菌生长发育及致病过程中的生物学功能,为深入了解杨树腐烂病菌致病机制以及制定病害防控策略提供科学依据。【方法】1)利用PCR技术克隆得到CcExo70基因的DNA序列; 2)通过生物信息软件对其编码的氨基酸序列进行特征分析并构建其同源基因的系统发育树; 3)通过PEG介导的遗传转化法得到CcExo70基因的敲除突变体及回补菌株; 4)通过PDA平板生长试验和PDB摇培试验,分析敲除CcExo70基因对该病菌生长发育、菌丝形态及H2O2胁迫响应的影响;通过对1年生欧美杨健康枝条烫伤接种的方法,测定CcExo70基因对该病菌致病性的影响; 5)利用荧光增白剂(CFW)、二氨基联苯胺(DAB)和FM4-64染剂探究各菌株中几丁质沉积、活性氧积累及内吞作用情况; 6)通过蛋白质组测序分析,筛选可能受CcExo70调控分泌的外泌蛋白。【结果】1)在杨树腐烂病菌中克隆得到了一个CcExo70基因,该基因全长1 992 bp,包含1个内含子,编码636个氨基酸。2)系统发育和序列比对分析表明,CcExo70与其他病原真菌的同源基因在进化上是高度保守的。3)利用遗传转化法筛选得到2个敲除突变体(ΔCcExo70-8、ΔCcExo70-9),并获得了回补菌株(ΔCcExo70/C)。4)表型分析发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体在菌丝生长、形态发生、氧化应激反应和致病力等方面存在显著的缺陷。5) CFW染色观察显示,野生型和回补菌株菌丝尖端存在明显的几丁质沉积,而敲除突变体菌丝尖端未见明显的几丁质沉积但菌丝隔膜异常增加。此外,共聚焦显微镜观察发现,与野生型和回补菌株相比,CcExo70敲除突变体的内吞作用显著延迟。6)蛋白组测序分析发现,8个候选的外泌蛋白在CcExo70敲除突变体胞外培养滤液中的含量显著低于在野生型胞外培养滤液中的含量(降低了50%以上),其中有4个候选的外泌蛋白(CcSP2、CcSP3、CcSP6、CcSP7)在胞外培养滤液中的含量显著高于其对应菌株的胞内含量,其中包括1个候选的效应分子(CcSP2)和2个糖苷水解酶(CcSP6和CcSP7),表明这4个外泌蛋白的分泌受到了CcExo70的调控。【结论】胞外分泌复合体亚基CcExo70在杨树腐烂病菌的生长、胁迫响应、内吞作用和致病性等方面起着重要的调控作用。

【目的】明确衔接蛋白(adaptor protein)GcAP1复合体β亚基在苹果炭疽叶枯病菌(Glomerella cingulata)生长发育和致病过程中的功能,检测GcAP1β在该菌中的时空表达模式,并揭示其是否调控多聚半乳糖醛酸内切酶(endopolygalacturonase)基因CgPG1和CgPG2、果胶裂解酶(pectin lyase)基因pnl-1和pnl-2以及果胶酸酯裂解酶(pectate lyase)基因pelA和pelB的表达,为深入开展苹果炭疽叶枯病菌衔接蛋白在致病信号传导途径

为探究杨树腐烂病菌的表观特征、遗传多样性以及它们与不同寄主杨树派别和病原菌地理来源的关系,本文收集来自我国14个省份的106份杨树腐烂病标本,纯培养观察记录菌落生长状况,分析菌株培养形态多样性,并从中选取背景信息差异较大的菌株34份,采用SRAP和ISSR两种标记方法分析其遗传多样性。结果显示:杨树腐烂病菌同一菌株在不同条件下的培养性状稳定;不同菌株的培养形态差异明显,且各类别间菌株的培养性状与寄主植物、地理来源没有明显相关性。利用获得多态性良好的12对SRAP引物和20条ISSR引物分析得出群体的Nei

通过培养基平板对峙培养,从292株放线菌中筛选出了8株对杨树腐烂病病原菌(Valsa sordida)有较强拮抗作用的菌株,再结合发酵液的生长抑制率测定,筛选出了1株抑菌效果最好的菌株,对其发酵液的萃取液进行了薄层层析分析,初步确定抑菌活性是由一种极性较弱的物质引起的,并对该物质的理化性质进行了研究,结果表明,此活性物质无挥发性,对酸、温度和紫外线都较稳定。

以甘蔗叶片总ＲＮＡ为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增细胞色素ｂ６－ｆ复合体铁硫亚基基因的Ｃ ＤＮＡ，采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性，并用荧光定量ＰＣＲ分析该基因的表达情况。结果表明：克隆得到的Ｃ ＤＮＡ片段长度为７９６ ｂＰ，包括１个５７９ ｂＰ的开放阅读框，编码１９２个氨基酸。甘蔗与高粱ＣＹＴ基因Ｃ ＤＮＡ序列的同源性为９４．０％，氨基酸序列同源性为９９．０％；该基因推导的蛋白分子量大小为２０．６７ＫＤ，等电点为６．２４，疏水性分值在０．５０～２．１１；蛋白二级结构中α－螺旋占１７．１９％，随机卷曲占５３．１２％，延伸链占２１．５３％，β－转角只占８．３３％，ＧｅＮ ｂＡＮＫ登录号．．．

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳...

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系，筛选最佳产酶的碳、氮源，为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907，致病力丧失突变体T1)菌株，于5，10，15和20 d时取样，用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性，探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株，改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株，于5，10，15和20 d时取样，分别测定各培养滤液中果胶酶的活性，确...

通过对酶活性的分析,研究证实苹果树腐烂病菌在活体外和寄主体内均能分泌一系列的细胞壁降解酶:多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纤维素酶(Cx)、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。不同碳源培养条件下,腐烂病菌产生细胞壁降解酶的活性及达到酶活性高峰的时间存在显著差异;诱导酶液对苹果愈伤组织具有明显的浸解作用,其中木聚糖为碳源产生的细胞壁降解酶,破坏能力最强。此外,研究发现,腐烂病菌在寄主体内产生细胞壁降解酶的活性变化规律不同,PMG和木聚糖酶在接种后最先被检测到活性显著升高,PMG酶活性于接种后第13天达到高峰,随后活性降低,而木聚糖酶和其他3种酶活性则随接种天数的增加活性不断增强;...

为有效控制苹果树腐烂病,通过对不同浓度青霉素处理后的感病植株的病原菌的果胶酶和人工培养的病原菌的果胶酶活性的测定。结果表明:不同浓度青霉素液处理对PA液中病源菌分泌果胶酶活性没有直接的抑制作用;不同浓度青霉素液对感病树体上病源菌分泌果胶酶活性有显著的抑制作用,其中经1.2×104U/L的青霉素液处理后的抑制效果最明显,处理35 d时,感病树体的病组织中果胶酶活性比CK下降了82%。

为明确植物光合作用中镁离子螯合酶ＣＨＬＩ与ＣＨＬＤ亚基形成复合物ＣＨＬＩ－ＣＨＬＤ这一重要过程的机制，首先需要获得可溶性ＣＨＬＩ和ＣＨＬＤ蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的ＣＨＬＩ和ＣＨＬＤ重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，添加异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）进行诱导表达。通过ＮＩ琼脂糖树脂（ＮＩ ｓＥＰＨａｒｏｓＥ ６ ＦａｓＴ ＦＬｏｗ）和谷胱甘肽琼脂糖树脂（ＧＬｕＴａＴＨＩｏＮｓＥＰＨａｒｏｓＥ ４ ＦａｓＴ ＦＬｏｗ）亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓＤｓ－ＰａＧＥ）和ＴＥＶ酶切试验验证目标蛋白。采用．．．

以菊花品种‘清露’cDNA为模板克隆出了菊花CmCSN1基因,并研究了CmCSN1在环境信号中的表达变化。序列分析表明:该基因编码442个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为50 397;CmCSN1基因在进化上是保守的,具有与动物相同的PCI结构域。荧光定量PCR分析结果显示:该基因在根、茎、叶和花中都有表达,但花中的表达量较高;弱光处理使CmCSN1表达量上调;CmCSN1白天比晚上的表达量高,有昼夜节律性;在花发育过程中,萌动期表达量很低,而紧蕾期表达量急剧增加,表明该基因可能在弱光胁迫响应以及花发育方面发挥作用。

【背景】microRNA-like RNA(milRNA)是真菌中普遍存在的一类与动植物microRNA具有相似生成和作用机制的调控因子，广泛参与其生长、发育，以及植物病原真菌的侵染致病等生命活动。苹果树腐烂病菌（苹果黑腐皮壳Valsa mali）引起的腐烂病是影响苹果生产的最具毁灭性的病害。【目的】探究Vm-milRN7调控苹果树腐烂病菌致病的功能及机理，为苹果树腐烂病的靶向性抗病育种提供理论依据。【方法】以03-8菌株基因组DNA为模板扩增Vm-milRN7前体序列并构建Vm-milRN7前体过表达载体；扩增Vm-milRN7前体上下游序列并利用Double-joint PCR技术构建Vm-milRN7前体敲除盒。利用PEG介导的原生质体转化法构建Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体。通过培养皿内生长试验及离体枝条、叶片接种试验分析Vm-milRN7前体过表达及敲除突变体对病菌营养生长及致病的功能。利用qRT-PCR以及烟草共转化试验验证Vm-milRN7对其靶标基因Vm-09496的调控作用；使用生物信息学软件对Vm-09496进行蛋白序列特征和系统发育分析。为解析其功能，创制Vm-09496的敲除突变体以及回补菌株，并鉴定其表型。【结果】利用PEG介导的遗传转化技术获得Vm-milRN7过表达转化株以及敲除突变体。营养生长观察发现，与野生型菌株相比，Vm-milRN7过表达转化株生长表型无明显差异，而敲除突变体营养生长速率显著降低；致病力检测发现，Vm-milRN7过表达转化株对苹果叶片的致病力显著增强，敲除突变体对苹果叶片和枝条的致病力均显著降低。qRT-PCR和烟草共转化试验分析发现，Vm-milRN7能够抑制其候选靶标基因Vm-09496的表达。生物信息学分析发现该基因编码一个假想蛋白，且与梨黑腐皮壳（V. pyri）中的VP1G＿09956进化关系最近。创制Vm-09496的敲除突变体和回补菌株，发现与野生型菌株相比，敲除突变体对枝条和叶片的致病力均显著提高，而回补菌株营养生长速率及致病力恢复至野生型水平。【结论】Vm-milRN7通过调控靶标基因Vm-09496的降解参与苹果树腐烂病菌致病过程。靶标基因Vm-09496是影响腐烂病菌侵染的重要内源基因，在苹果树腐烂病菌内负向调控致病力。

【目的】建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础。【方法】以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析。【结果】采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17cm pH 4.07.0IPG胶条,对苹果树腐烂病

【目的】腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树。论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据。【方法】通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖部位,测试低温冷冻、枝条浸水后冰冻、枝条失水、枝条龄期等因子对接种腐烂病菌侵染致病的影响。【结果】8月份用分生孢子喷雾接种的苹果树,次年3月份检测,7个枝位的带菌率都接近或超过90%;接种到伤口上的腐烂病菌主要定殖于伤口坏死组织内,并在死组织内生长扩展,但没有穿透伤口外围的愈伤木栓层而侵入活体的皮层组织致病;在检测的6个枝位中,新鲜伤口对腐烂病菌侵染致病最为敏感,接种发病率最高,果柄痕次之,叉丫、芽眼和果苔枝的敏感性稍差,发病率稍低,皮孔抗病性最强,接种病菌不能致病;低温冷冻和浸水后冰冻(枝条上形成冰晶)都能增加枝条芽眼部位对接种腐烂病菌的感病性,其中-25和-18℃两个温度下处理枝条的接种发病率显著高于-10、-7和0℃3个温度处理枝条的接种发病率,浸水后冰冻枝条(模拟冬季降水后结冰的枝条)的接种发病率显著高于相同温度处理未结冰枝条的发病率;在低温冷冻和浸水后冰冻处理的枝条中,一年生枝条的接种发病率显著高于二年生枝条的发病率;一年生枝条经浸水冰冻处理后,梢部的接种发病率显著高于同一枝条基部的发病率;浸水后冰冻再经失水处理枝条(模拟枝条越冬后因大风、高温等失水),对腐烂病菌的侵染致病更加敏感,接种发病率显著高于浸水后冰冻枝条的发病率,而且失水量越大,接种发病率越高,芽眼部位的接种发病率最高可达85%。【结论】腐烂病菌易在苹果枝干上定殖,定殖病菌主要在伤口或枝干表层死组织内存活并生长,定殖病菌能否侵染致病关键取决于环境因子对枝条栓皮层的破坏;低温冷冻,尤其低于-15℃的低温冻害能破坏枝条的栓皮层和皮层,增加苹果枝条对腐烂病菌侵染致病的敏感性;与低温冷冻相比,浸水后冰冻对枝条栓皮层的破坏作用更大,结冰枝条对腐烂病更加敏感;枝条浸水冰冻后再失水,对枝条的破坏作用尤为严重,枝条越冬后失水能显著增加其对腐烂病菌侵染致病的敏感性;枝条的龄期不同,栓皮层的发育成熟度、强度和韧度各不相同,受不良环境因子的影响后,其受到破坏的程度也不同;树体不同部位栓皮层的结构不同,对腐烂病菌侵染致病的敏感性也存在明显差异。

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Ｖａｌｓａ ｍａｌｉ）两个多聚半乳糖醛酸酶（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ，ｐｇ）基因Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响，明确Ｖｍｐｇ７和Ｖｍｐｇ８在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过ｑ ｒｔ－ｐｃｒ检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后ｐｇ家族内其他ｐｇ基因的表达量；利用ｄｏｕｂｌｅ－ｊｏｉｎｔ ｐｃｒ构建基因敲除载体并通过ｐ．．．