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[期刊] 林业科学研究
[作者]
李泽华 杜娟 贺学娇 赵树堂 刘颖丽 卢孟柱
[目的]DET2基因编码一个5α-还原酶,是油菜素内酯(BRs)合成过程中的关键限速基因。研究DET2基因在杨树生长发育中的作用,对于进一步研究油菜素内酯在木本植物中的调控机制有重要意义。[方法]从银腺杨84K(Populus alba×P. glandulosa,‘84K’)克隆得到拟南芥AtDET2同源基因PagDET2,利用生物信息学对其进行序列比对、生化特征分析、构建系统发育进化树。通过RT-PCR分析其在杨树中的表达模式。构建由CaMV 35S强启动子驱动的过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化84K杨,得到PagDET2-OE转基因植株。分析过表达DET2基因对于转基因植株内源BRs含量、植株生长和抗逆的影响。[结果]克隆了包含全长编码区PagDET2基因全长,可编码一个长度为257个氨基酸的蛋白质。其蛋白序列与毛果杨、拟南芥、水稻、棉花、大豆、番茄DET2蛋白同源性较高,说明该基因在进化过程中相对保守。PagDET2在84K杨不同组织中均检测到表达,其在茎中的表达较高。通过ELISA检测植物BRs含量发现,过量表达DET2可以显著提高杨树内源BRs含量。过量表达DET2基因,可以导致转基因植株的高生长,但对盐胁迫更加敏感。[结论]DET2基因作为BRs合成的关键基因,在杨树中过量表达可以显著提高内源BRs含量,促进植株增高。DET2转基因植株的获得为进一步分析BR参与木本植物生长发育的调控机制奠定了基础。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王峰 刘木兰 马肖 张秋平
以高抗菌核病的油菜品种湘油15和高感菌核病的油菜品种98C40为材料，采用RT-PCR方法克隆了BnPMEI1基因的编码区全长，利用生物信息学软件和实时荧光定量PCR分析了BnPMEI1的结构和表达特性，并构建了该基因超表达载体，初步分析了该基因的功能。序列分析表明，该基因编码区全长615 bp，编码204个氨基酸，具有1个信号肽和1个PMEI结构域，属于PMEI家族基因，命名为BnPMEI1(GenBank登录号为ON254917)。表达分析表明，油菜BnPMEI1在根、茎、花、叶、角果皮和籽粒中均有表达，在叶中的表达量最高，根中的表达量最低；湘油15的茎、叶、花中的表达量均显著高于98C40的。在核盘菌、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)处理下，BnPMEI1在湘油15中的表达上调，在98C40中的表达则受到抑制；乙烯处理下，BnPMEI1在2个品种中的表达均下调，在湘油15中下调的幅度更大；离体叶片接种结果显示，超表达BnPMEI1的油菜突变体叶片病斑明显小于野生型叶片的。综合分析，BnPMEI1基因可能介导了SA和茉莉酸途径的调控，诱导油菜的菌核病抗性提高。
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
王峰 刘木兰 马肖 张秋平
以高抗菌核病的油菜品种湘油15和高感菌核病的油菜品种98C40为材料，采用RT-PCR方法克隆了BnPMEI1基因的编码区全长，利用生物信息学软件和实时荧光定量PCR分析了BnPMEI1的结构和表达特性，并构建了该基因超表达载体，初步分析了该基因的功能。序列分析表明，该基因编码区全长615 bp，编码204个氨基酸，具有1个信号肽和1个PMEI结构域，属于PMEI家族基因，命名为BnPMEI1(GenBank登录号为ON254917)。表达分析表明，油菜BnPMEI1在根、茎、花、叶、角果皮和籽粒中均有表达，在叶中的表达量最高，根中的表达量最低；湘油15的茎、叶、花中的表达量均显著高于98C40的。在核盘菌、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)处理下，BnPMEI1在湘油15中的表达上调，在98C40中的表达则受到抑制；乙烯处理下，BnPMEI1在2个品种中的表达均下调，在湘油15中下调的幅度更大；离体叶片接种结果显示，超表达BnPMEI1的油菜突变体叶片病斑明显小于野生型叶片的。综合分析，BnPMEI1基因可能介导了SA和茉莉酸途径的调控，诱导油菜的菌核病抗性提高。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李兵 刘志全 王璐琳 胡建军 唐铭霞 戴成 王克秀 马朝芝
【目的】在甘蓝型油菜中克隆拟南芥MYB-CC家族转录因子AtPHL12的同源基因BnPHL12并进行生物信息学、组织表达模式、亚细胞定位及转录活性研究，为BnPHL12的基因功能研究奠定基础。【方法】利用序列比对方法（blast）在甘蓝型油菜泛基因组数据库BnIR中鉴定AtPHL12的同源基因BnPHL12，在“Westar”品系中克隆AtPHL12的同源基因，进行生物信息学及进化分析。利用qRT-PCR及GUS染色方法检测AtPHL12同源基因在不同组织中的表达水平，利用原生质体转化的方法检测BnPHL12的亚细胞定位及转录活性。利用农杆菌侵染介导的转化方法，创建BnA01PHL12过量表达转化植株，并进行BnA01PHL12功能分析。【结果】在“Weatar”材料中克隆到4个AtPHL12的同源基因，命名为BnA01PHL12（705 bp），BnC01PHL12(705 bp)，BnA05PHL12(705 bp)和BnC05PHL12(696 bp)，分别编码234、234、234、231个氨基酸，与AtPHL12的序列相似性大于70%，均含有保守的MYB DNA结合结构域和Coiled-Coiled结构域。BnA01PHL12与BnC01PHL12分别来源于白菜的BraA01t04110Z、甘蓝的BolC01g050170.2J。BnPHL12的同源基因在根、茎、叶、花蕾中均有表达，在根和叶的表达水平更高；BnA01PHL12与BnC01PHL12在花药发育的早期和晚期均有较高的表达水平。BnA01PHL12定位在细胞核中并具有转录激活活性。在甘蓝型油菜和拟南芥中，利用绒毡层特异表达基因BnA9启动子驱动BnA01PHL12表达，导致转基因材料雄性不育。【结论】在甘蓝型油菜中，AtPHL12的4个同源基因具有保守的MYB 和CC结构域，在营养器官和生殖器官中均有表达。通过在绒毡层细胞中过量表达BnA01PHL12，创制了新的雄性不育材料，为研究花药发育提供良好基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
刘唱 杨洋 俞静 李燕 刘海龙 张昌伟 侯喜林 李英
[目的]CC-NBS-LRR(卷曲螺旋-核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复,CNL)是高度保守的植物抗病蛋白家族。本文旨在克隆和研究CNL基因在不结球白菜抗霜霉病中的作用。[方法]以‘苏州青’c DNA为模板克隆获得BcCNL基因全长,并进行生物信息学分析、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测、亚细胞定位及病毒诱导基因沉默(VIGS)验证。[结果]BcCNL基因含有2 790 bp开放阅读框,编码929个氨基酸,蛋白质相对分子质量为226.7,等电点为2.7。系统进化树结果显示,不结球白菜BcCNL蛋白与野甘蓝的进化关系最近,含有RX-CC、NB-ARC和LRR-3结构域;亚细胞定位显示其定位于细胞膜上。霜霉菌侵染后,BcCNL基因在抗病品种‘苏州青’中的表达量高于感病品种‘矮脚黄’; BcCNL基因的沉默降低了‘苏州青’对霜霉病的抗性。[结论]BcCNL蛋白在进化过程中保守性较高,定位于细胞膜上,BcCNL基因的沉默降低了‘苏州青’对霜霉病的抗性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
任海波 刘同坤 袁敬平 吴小婷 王惠玉 侯喜林
[目的]本文旨在分析不结球白菜BcICE1基因的表达模式并探索其在冷胁迫中的功能。[方法]以不结球白菜品种‘NHCC001’为材料,采用同源克隆的方法获得BcICE1基因的全长序列,并进行生物信息学分析;对‘NHCC001’进行4℃低温和PEG-6000模拟干旱处理,检测BcICE1基因对胁迫的响应;构建过表达载体pEarly Gate-BcICE1,利用注射法将载体农杆菌菌液导入烟草细胞进行BcICE1基因的瞬时表达并检测;构建酵母诱饵载体p GBKT7-BcICE1,转化AH109验证其转录激活活性;将pEarly Gate-BcICE1农杆菌菌液利用蘸花法进行BcICE1基因的遗传转化,并用RT-qPCR和Western blot对阳性苗进行鉴定。通过RT-qPCR对BcICE1过表达拟南芥中冷胁迫相关基因的表达水平进行分析。[结果]克隆获得不结球白菜BcICE1基因,其含有1 338 bp的开放阅读框,编码466个氨基酸,相对分子质量为47.40×103,等电点为5.42;氨基酸的多序列比对和系统进化树结果表明,BcICE1蛋白与欧洲油菜、荠菜和拟南芥ICE1蛋白同源关系较近。亚细胞定位表明BcICE1蛋白定位在细胞核中,具有转录激活性且对冷胁迫与干旱胁迫有响应。BcICE1过表达株系能增强植株的抗寒性,同时在低温处理后BcICE1过表达植株中冷胁迫相关基因At CBF3和COR15A的表达量显著高于野生型植株。[结论]克隆并获得BcICE1过表达拟南芥植株,功能分析表明BcICE1基因能增强植株抗寒性。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
文锴 王远 胡蝶 袁敬平 侯喜林 李英
[目的]12-氧-植物二烯酸还原酶(12-oxo-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸生物合成途径的关键酶,催化12-氧-植物二烯(OPDA)还原反应生成茉莉酸化合物,广泛参与植物生长过程中的防御系统。本文旨在克隆和研究不结球白菜Bc OPR3基因,研究其对信号分子和非生物胁迫应答的影响。[方法]对不结球白菜OPR3基因进行克隆、生物信息分析、亚细胞定位,并对其在霜霉病菌、脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、机械伤害、低温和热激胁迫下的表达水平进行了分析。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
董慧霞 理永霞 贾秀贞 吕全 张星耀
【目的】克隆84K杨水杨酸结合蛋白2(Salicylic acid-binding protein 2,SABP2)基因并预测其功能。【方法】以生长至5片小叶的84K杨组培苗为材料,提取其叶和茎的总RNA。根据毛果杨SABP2基因(GenBank序列号:XM_002310718.2)的完整CDs序列,设计84K杨SABP2基因的引物,采用RT-PCR技术扩增84K杨SABP2基因全长,然后连接到pGM-T克隆载体,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,对84K杨SABP2基因进行克隆,获得该基因的全长序列。通
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
何学高 赵爱国 谢冬冬 黄晓华
【目的】克隆漆树(Toxicodendron vernicifluum(Stokes) F. A. Barkl.)叶片中的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因并分析其结构特征,明确该基因编码蛋白的酶活性及该基因的抗逆性,为其功能研究提供理论依据。【方法】根据已有的漆树叶片转录组数据,利用RT-PCR克隆漆树GST基因,应用生物学网站对其所编码蛋白的理化性质进行分析,并构建系统进化树和三维结构模型;利用原核表达系统和Ni-NTA亲和层析技术表达、纯化漆树GST重组蛋白,并利用不同底物测定重组蛋白的酶活性;将原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),验证该基因对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物逆境胁迫的耐受性。【结果】获得了漆树谷胱甘肽S-转移酶基因TvGST7(GenBank登录号为MK956145)的完整编码序列,开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸,分子质量为27.17 ku,理论等电点为5.25;进化树分析和三维结构模拟表明,TvGST7蛋白属于Lambda(L)亚家族。酶活性测定结果显示,重组蛋白TvGST7具有巯基转移酶活性;胁迫试验表明,TvGST7的表达能增强大肠杆菌对低温、高温、高盐、高渗透压等非生物胁迫的抗性。【结论】根据TvGST7重组蛋白具有巯基转移酶活性及TvGST7的表达提高了大肠杆菌对非生物胁迫的抗性,推测TvGST7基因在漆树中的表达对于维持漆树体内的正常代谢和清除非生物胁迫产生的氧化损伤起着重要作用。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周敏 程华 张子昕 邢晓娟 蒋甲福 陈发棣
[目的]本文旨在通过克隆菊花中的乙烯受体基因(CmETR2),分析其表达特征并转入拟南芥中对其调控开花的功能进行研究。[方法]以菊花品种‘神马’为试验材料,克隆CmETR2全长序列,与其他物种进行同源性比对分析,利用荧光定量PCR检测该基因在不同组织中的相对表达量,以及其对外源乙烯处理后的响应变化。将CmETR2超表达转入拟南芥中,观察其对拟南芥开花时间和莲座叶片数的影响,分析转基因拟南芥中开花相关基因的表达量变化。[结果]克隆获得的CmETR2基因开放阅读框(ORF)全长为2 292 bp,编码氨基酸763个。系统进化分析表明,该基因编码的蛋白与向日葵的ETR3(XP_022030036.1)和刺菜蓟的ETR2-like(XP_024986908.1)亲缘关系最近。组织特异性定量表达分析结果表明,CmETR2在菊花营养生长期间茎和叶中表达量最高,生殖生长期间管状花和根中的表达量较高。亚细胞定位结果表明,CmETR2定位在细胞膜上。外源乙烯处理后3 h CmETR2基因表达量最高。CmETR2超表达植株的开花时间比野生型拟南芥晚3～4 d,开花时莲座叶片数比野生型拟南芥多3片左右。CmETR2超表达植株对乙烯的敏感性增强并表现出更明显的三重反应。在CmETR2超表达植株中,促进开花的基因AtGI、AtSPL3和AtFD在CmETR2超表达植株中的表达量较野生型下降,抑制开花的基因AtFLC和AtTFL在CmETR2超表达植株的表达量上调。[结论]本研究克隆得到菊花CmETR2基因具有延迟拟南芥开花的功能。
关键词：
菊花 CmETR2基因 乙烯受体 开花
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
郭鹏 张士刚 邢鑫 姜健
欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。Pd PP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受Na Cl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转Pd PP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明Pd PP2...
关键词：
欧美杨 PP2C基因 克隆 表达 逆境
[期刊] 中国农业科学
[作者]
孙清鹏 李娜 于涌鲲 赵福宽 万善霞 潘金豹
【目的】克隆番茄WRKY2转录因子,为研究番茄抗病反应的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】根据克隆出的番茄LeWRKY2基因特异片段(GenBank登录号:EU755368.1),运用cDNA末端快速扩增(rapidamplification of cNDA ends,RACE)技术克隆番茄LeWRKY2 cDNA全长,并用生物信息学的方法对其进行分析。用实时荧光定量PCR方法检测番茄经JA、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、放线菌酮(cycloheximide)刺激时LeWRKY2基因的表达情况。【结果】①从番茄中克隆到一条全长为1 007 bp的cDNA序列,命名为LeWR...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
姜树坤 黄成 徐正进 陈温福
【目的】通过比较控制株高及其构成因素的QTL与赤霉素和油菜素内酯合成及信号转导相关基因的关系,为明确株高的分子调控机制提供理论参考。【方法】利用沈农265和丽江新团黑谷杂交构建的粳-粳交重组自交系为作图群体,对水稻株高及其构成因素进行QTL定位,并与控制赤霉素和油菜素内酯合成及信号转导的相关基因进行比对分析。【结果】RILs群体的株高及各个构成因素均呈正态分布。株高与各构成因素间呈正相关。相邻的构成因素间呈极显著的正相关,而相距较远的构成因素间的相关性减弱甚至负相关,进一步分析表明,株高主要受倒1和倒4节间长度的影响。共检测到21个控制株高及其构成因素的QTL,分布在第1、2、3、5、6、7、...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
严明理 刘忠松 官春云 陈社员 刘显军 袁谋志
【目的】分离和克隆芥菜型油菜类黄酮合成相关基因。【方法】采用同源克隆基因的方法,参照拟南芥等植物控制类黄酮合成的基因保守序列设计引物,对扩增片段进行测序并进行BLAST分析。【结果】有13对引物扩增的17个基因拷贝与参考基因序列相符,这些克隆属于13个已知功能基因,其中查尔酮合成酶基因有3个不同的基因拷贝,花色素形成(Production of anthocyanin pigment)基因和查尔酮异构酶基因分别有2个不同的基因拷贝,其余引物的扩增只获得一个拷贝。在GenBank数据库中进行检索表明,所克隆的基因拷贝中的DNA结合/转录因子基因(TT2、TT8、TTG2)、花色素形成基因(PAP...
关键词：
芥菜型油菜 类黄酮 基因
[期刊] 中国农业科学
[作者]
吴转娣 刘新龙 刘家勇 昝逢刚 赵培方 林秀琴 陈学宽 苏火生 刘洪博 吴才文
【目的】克隆甘蔗的Ｓｃ ｃｃＤ８，分析其序列特征并预测其功能，研究在甘蔗不同组织部位、不同胁迫处理条件以及不同生长时间点ＳｃｃｃＤ８的表达情况，为该基因在甘蔗基因工程育种中的应用提供理论支撑。【方法】以ＮｃＢＩ中检索的甘蔗ｃｃＤ８同源片段ＥＳＴ序列为模板设计引物，扩增甘蔗ｃｃＤ８的片段，采用ＲＡｃＥ和ＲＴ－ＰｃＲ技术分别从甘蔗品种新台糖２２号中克隆ｃｃＤ８的５′、３′目的片段和全长ｃＤＮＡ序列，以生物信息学方法对序列进行预测分析，利用ｑＲＴ－ＰｃＲ方法分析ｃｃＤ８在不同组织、不同逆境胁迫条件下和不同生长时间点的表达特性。【结果】克隆获得甘蔗ｃｃＤ８，命名为ＳｃｃｃＤ８，ＧＥＮ ＢＡＮｋ登录号为．．．
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