【目的】对来航鸡ＦＯＸＬ２基因进行真核表达及纯化，为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据ＧｅｎＢａｎｋ已发表的来航鸡ＦＯＸＬ２基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＪＦ＿７０８８６８．１）设计引物，以来航鸡全血Ｄｎａ为模板，ＰＣＲ扩增ＦＯＸＬ２基因，经ｅＣＯＲⅠ和ＸＢａⅠ双酶切后定向克隆于ＰＰＩＣＺαａ中，获得ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体。将ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２转化毕赤酵母菌ＧＳ１１５，用甲醇进行诱导表达，对表达产物进行ＳＤＳ－ＰａＧｅ和ＷｅＳｔｅＲｎ ＢＬＯｔｔＩｎＧ检测。【结果】克隆了９１８ＢＰ的ＦＯＸＬ２基因；成功构建了ＰＰＩＣＺαａ－ＦＯＸＬ２真核表达载体；实现了ＦＯＸＬ２．．．

以栉孔扇贝(Chlamys farreri)卵巢cDNA为模板,采用PCR扩增Foxl2(forkhead box l2)基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,筛选鉴定阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以IPTG诱导Foxl2蛋白表达,用SDS-PAGE鉴定表达情况,经镍柱纯化表达蛋白,通过免疫新西兰白兔(New Zealand white rabbits)制备多克隆抗体,以ELISA测定抗体效价,最后用WB(Western Blot)检测抗体特异性。结果表明,重组载体转化BL21后经1.0 mmol L~(-1)IPTG于37℃诱导6 h可产生大量Foxl2蛋白,主要以包涵体形式表达。经镍柱柱纯化可得到纯度较高的Foxl2蛋白,浓度达800 ug·mL~(-1)。免疫新西兰白兔获得多克隆抗体,效价大于1∶128 000。WB检测显示:该抗体能特异识别扇贝卵巢中的Foxl2蛋白,同时发现Foxl2蛋白在卵巢中强表达,而在精巢中几乎不表达,揭示栉孔扇贝中该蛋白具雌性性别相关性。研究成功获得效价高且能特异识别天然Foxl2的多克隆抗体,为后续深入研究Foxl2在栉孔扇贝卵巢中的功能提供了分子工具。

Foxl2基因在哺乳动物中是雌性相关基因,参与卵巢发育和功能维持。本研究利用荧光定量PCR和原位杂交技术,对栉孔扇贝(Chlamys farreri)foxl2(Cf-foxl2)在发育过程中的表达图式进行了分析。研究发现Cf-foxl2在受精卵中呈低水平表达,随着发育进行表达量增高,D形幼虫期表达量最高,之后表达量迅速下降。原位杂交结果显示Cf-foxl2表达量在担轮幼虫之前在体内均匀分布;强阳性信号在担轮幼虫口凹附近呈对称分布;至D形幼虫期强阳性信号主要集中在内脏团和外套膜边缘处;之后信号消失,直到性别分化后在卵巢中再次出现。本实验结果暗示Cf-foxl2与卵巢发育相关,鉴于该基因在发育早...

[目的]本研究旨在构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞细胞中转染表达。[方法]通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG1的全基因序列,经T_4连接酶将载体PCDNA3.1(-)与酶切bPAG1片段连接,构建PCDNA3.1(-)-bPAG1重组载体后转染到CHO细胞,经SDS-PAGE和Western Blot检测重组牛妊娠相关糖蛋白1(rbPAG1)的表达效果。[结果]PCR扩增得到1218 bp的bPAG1基因片段,构建的重组质粒PCDNA3.1(-)-bPAG1经双酶切获得约5400和1218 bp的2条片段,与预期相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致;SDS-PAGE和Western Blot鉴定显示,获得相对分子质量约为62 kDa的bPAG1重组蛋白,通过Ni柱亲和层析纯化后,rbPAG1纯度可达88%。[结论]本研究为bPAG抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研发奠定了基础。

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结...

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总ＲＮＡ，采用ＲＴ–ＰＣＲ方法扩增和克隆红鳍东方鲀Ｆｏｘｏ１基因的ｏＲＦ，并构建其原核表达载体Ｐ ＥＴ–３２／Ｆｏｘｏ１，在大肠杆菌ＲｏｓＥＴＴＡ（ＤＥ３）进行表达，通过ＩＰＴＧ诱导表达，对重组Ｆｏｘｏ１蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定，结果表明：重组质粒Ｐ ＥＴ３２Ａ／Ｆｏｘｏ１被成功构建；用ＩＰＴＧ进行诱导表达，融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在，能与抗ＨＩｓ标签的兔多克隆抗体发生特异性反应；纯化出了融合表达蛋白，获得了相对分子质量约为１１０ ０００的重组蛋白。

foxl2是性腺分化、发育和维持等发育过程的转录调节因子，在一些哺乳动物和鱼类的卵巢发育中发挥了重要作用。本研究比较分析了性成熟前后罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)foxl2基因在肝胰腺与卵巢中的表达，并利用RNA干扰技术沉默MrFoxl2(M.rosenbergii foxl2)基因后分析其在卵巢成熟过程中的功能。荧光定量结果显示，MrFoxl2在卵巢组织中高表达，并且性成熟后MrFoxl2在卵巢中的表达较性成熟前显著提高。在注射MrFoxl2-dsRNA后MrFoxl2基因的表达显著下降，并且使用1μg/g的注射剂量对MrFoxl2基因的敲降效果最佳。此外，MrFoxl2基因沉默后，生殖相关基因VG与EcR的表达显著下调，CatL基因表达显著上调。研究结果表明，MrFoxl2在罗氏沼虾卵巢成熟过程中可能发挥了重要作用。

Foxl2是叉头状转录因子(forkhead transcription factor， Fox)基因家族的重要成员之一，在卵巢发育和性别调控中发挥着重要作用。为探究Foxl2在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)性腺发育中的表达调控模式，利用生物信息学方法分析了虾夷扇贝Foxl2的序列特征；采用半定量PCR(RT-PCR)检测了Foxl2在不同组织中的表达差异。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和原位杂交技术(ISH)揭示了Foxl2在性腺发育4个时期(增殖期、生长期、成熟期和排放期)的时空表达变化。结果显示，虾夷扇贝Foxl2序列包含Fox基因家族共有的FH结构域；多重序列比较分析显示，虾夷扇贝与栉孔扇贝(Chlamys farreri)、欧洲大扇贝(Pecten maximus)的相似性最高，分别为98%、96%。系统进化树分析显示，在不同物种以及进化的过程中，Foxl2基因具有较高的保守性。定量分析和原位杂交结果显示，原位杂交阳性信号主要定位在生殖细胞的细胞质中。在虾夷扇贝的鳃、肾、肝胰腺、精巢中，都可检测到少量Foxl2转录本的存在，在卵巢中表达量最高，且在卵巢成熟期达到最高值。随着性腺发育和精细胞的逐级分化，Foxl2的表达量呈下降趋势，这与原位杂交的结果一致。研究结果表明，Foxl2在虾夷扇贝卵巢发育中可能发挥重要作用，推测其是雌性虾夷扇贝性腺发育调控中的关键基因，可为今后阐明其在虾夷扇贝性别分化进程中的功能提供理论依据。

为研究海带核基因组编码的nuc Cbb X蛋白的结构和功能,根据海带配子体核基因cbb X(Gen Bank登录号:NP_053838)设计含有酶切位点的引物,通过RT-PCR方法获得末端连接NdeⅠ、XhoⅠ酶切位点的完整ORF。序列保守性分析表明,预测的海带成熟nuc Cbb X蛋白序列含具有AAA+结构域、Walker-A和Walker-B ATP结合位点及ATP水解酶和Ru Bis Co活化酶活性相关位点。序列相似度分析表明,海带nuc Cbb X与其质体基因组编码的pt Cbb X和类球红细菌的Rs Cbb X蛋白氨基酸序列相似度均较低,分别为37.4%和36.8%,相比pt Cbb...

为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体。随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定。将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF。GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化...

海七鳃鳗(Petromyzon marinus)是现存最古老的无颌类脊椎动物之一,对其重要免疫分子的研究在免疫系统的进化理论上有重要意义。细胞趋化因子CXCL8(又称白细胞介素-8,Interleukin 8)是最重要的趋化因子之一。为了研究海七鳃鳗CXCL8基因在天然免疫中的作用,以海七鳃鳗肝脏c DNA为模板,通过比对海七鳃鳗基因组信息设计引物,使用RT-PCR方法扩增得到PmCXCL8基因。随后构建原核表达载体pColdI-CXCL8,将载体转化至E.coli BL21和Rosetta(DE3)中进

通过PCR扩增,从pCAMBIA1300-bar质粒中获得bar基因编码区全长,经酶切鉴定和测序后证实,bar基因分离成功。用BamH和Hind酶切,将bar基因与原核表达载体pET28a(+)连接,构建成重组质粒pET28bar。将重组质粒pET28 bar转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)后,获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在,蛋白质分子量约为27 ku。将包涵体离心、洗涤和纯化后,得到高纯度的目的蛋白。该蛋白可以替代植物外源蛋白进行转bar基因产品的食用安全性检测,也可用于转bar基因产品ELISA检测的抗体制备。

本试验旨在原核表达、纯化羊口疮病毒ORF080蛋白并鉴定其反应性.根据GenBank已发表的羊口疮病毒OV-GO株ORF080基因序列(登录号:KP010354),将密码子优化后合成该序列并克隆至pET-32a(+)原核表达载体中,构建pET-32a(+)-ORF080重组质粒.经双酶切和测序鉴定后转化至大肠杆菌Rossetta感受态细胞中,用IPTG诱导,诱导产物经SDS-PAGE鉴定,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式获得表达.采用镍柱对可溶性重组蛋白进行纯化,再经SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹双重鉴定.SDS-PAGE检测结果显示,在57 ku处出现单一重组蛋白条带;蛋白质免疫印迹鉴定证实该纯化的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体和羊口疮阳性血清发生特异性反应,证明成功表达并纯化出具有良好反应性的ORF080蛋白.试验结果为进一步对ORF080蛋白结构、功能及基因工程疫苗的研究提供参考.

利用Trizol法从尖音库蚊中提取总RNA,构建cDNA文库,并克隆出乙酰胆碱酯酶外显子序列;利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对蚊虫乙酰胆碱酯酶进行真核表达,并利用Ni-琼脂糖对酶进行纯化。采用SDS-PAGE对纯化产物进行检测,结果表明得到了纯度较高的乙酰胆碱酯酶。参照Ellman法对酶的活性进行测定,结果显示纯酶的活力为2.219×10-4 mol/(min.g)。

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot结果显示激活素A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavageenzyme,CYP11A1orP450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素A重组蛋白,为下一步激活素A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。