以化学诱变剂EM S处理小麦条锈菌CY 17和CY 31的夏孢子诱发其毒性突变,用抗条锈Y r近等基因系筛选毒性突变体,建立了4个CY 17和1个CY 31的突变菌株,各筛选品种上的病菌突变频率明显不同,突变率在2.14×1-0 6~3.68×1-0 5。对突变菌株的毒性测定结果表明,CY 17的所有突变菌株对Y r12发生了毒性突变,且CY 17和CY 31的所有突变菌株对Y r5,Y r10,Y r15和Y r24等4个抗病基因表现无毒性。研究证实毒性突变是小麦条锈病菌毒性变异的重要途径。

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中...

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,Ta...

[目的]克隆小麦条锈菌诱导的小麦TaRRP4基因,研究其在小麦与小麦条锈菌互作、非生物胁迫、外源激素处理下的表达特征,为小麦与小麦条锈菌互作中该基因功能的验证及小麦抗病育种提供参考。[方法]以小麦品种水源11、小麦条锈菌生理小种条中23号(CYR23)和条中31号(CYR31)为材料,采用RT-PCR法,从小麦条锈菌侵染的水源11小麦cDNA中克隆得到1个外切体亚基TaRRP4基因,利用生物信息学对其序列进行分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同处理下TaRRP4基因在各个时间点的相对表达量,其中小麦条锈菌处理体系包含非亲和体系(CYR23与水源11)和亲和体系(CYR31与水源11),非生物胁迫处理包含高盐、干旱、低温和机械损伤处理,外源植物激素处理包含脱落酸、茉莉酸甲酯、乙烯利和水杨酸处理,另外分析该基因在小麦不同组织(根、茎和叶)中的表达情况。[结果]克隆获得小麦TaRRP4基因序列,其开放阅读框为951 bp,编码316个氨基酸;同源氨基酸序列比对结果表明,TaRRP4与拟南芥AtRRP4p氨基酸相似度达62.96%,且均属于外切体亚基RRP4家族,包含类核糖体蛋白S1和KH 2个RNA结合结构域。qRT-PCR结果表明,与小麦条锈菌诱导0 h相比,小麦条锈菌CYR31诱导后,TaRRP4在诱导24,48和72h极显著上调表达;而受小麦条锈菌CYR23诱导后,TaRRP4仅在诱导48 h显著上调,且上调倍数较小。与各个非生物胁迫小麦处理0 h相比,高盐胁迫下,TaRRP4在处理12和48 h分别极显著和显著上调;干旱胁迫下,TaRRP4在处理2和6 h均极显著上调表达;低温胁迫下,TaRRP4从处理2 h开始极显著或显著上调,直至48 h表达量降低;而机械损伤处理对TaRRP4的表达量没有显著影响。与各个外源植物激素处理小麦0 h相比,脱落酸可在处理12和24 h诱导TaRRP4下调表达,茉莉酸甲酯对TaRRP4的表达量没有显著影响,而乙烯利和水杨酸均可在处理2,6和12 h诱导TaRRP4上调表达。同时,TaRRP4基因在小麦根、茎、叶中均有表达,且在叶片中的表达量最高,显著高于其在小麦根、茎中的表达量。[结论]克隆得到小麦条锈菌诱导的小麦外切体RNA结合蛋白TaRRP4基因,该基因可能通过脱落酸、乙烯利和水杨酸信号交流,在小麦条锈病的防御反应中发挥负调节作用,同时在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中发挥重要作用。

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG...

【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还...

采用活体注射法将不同浓度的钙信使阻断及激活药物注入小麦叶片,其中阻断药物注射后立即接种叶锈菌,研究了钙信使与小麦受叶锈菌侵染诱导的防卫反应的关系。结果表明,用Ca2+螯合剂EGTA除去或降低胞外Ca2+浓度,用Ca2+通道阻断剂Verapamil或La3+阻断胞外Ca2+进入胞质,都能部分地抑制叶锈菌诱导的防卫反应,即PAL,POD的活性升高和过敏性反应(HR)的发生。抑制程度随药物浓度升高而增高。注射Ca2+载体A23187能部分模拟叶锈菌侵染诱导的这3种防卫反应。说明叶锈菌侵染诱导的PAL,POD活性升高和HR的发生,需要胞外Ca2+进入胞内,Ca2+参与了叶锈菌侵染激活防卫反应的信号转导...

【目的】β-1,3-葡聚糖酶是一种病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白,了解小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因在叶锈菌(Puccinia triticina)与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1,3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生...

【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列(Unigene),与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的ES...

小麦接种高度非亲和性的小麦秆锈菌后,在其细胞间隙液(IWF)中可能存在激发子。通过硫酸铵沉淀法将其分级,再将各分级沉淀蛋白溶液注射到高度非亲和性互作小麦叶片中,观察过敏性坏死反应(HR)和过氧化物酶(POD)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化。结果表明:激发子成分主要集中在50%~80%硫酸铵沉淀蛋白部分中,能明显诱导叶片发生过敏性坏死反应;40μg/mL的该分级沉淀蛋白溶液处理小麦叶片后,PAL和POD活性在早期已有显著增加,分别在诱导处理后36 h和60 h左右出现最高峰,较对照分别增加了37.47%和78.20%。

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因ＰｓＰＬ１的功能，确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用，为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用ＲＡＣＥ技术扩增ＰｓＰＬ１基因全长，通过ｑＲＴ－ＰＣＲ对ＰｓＰＬ１的表达特征进行分析，并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能，最后通过ＨＩＧｓ技术沉默ＰｓＰＬ１基因，确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到ＰｓＰＬ１基因全长，其ＯＲＦ长４７１ｂＰ，编码１５７个氨基酸；经预测ＰｓＰＬ１蛋白包含一个果胶酶保守结构域，Ｎ端含有一段由２１个氨基酸组成的信号肽序列；经酵母系统验证，确定ＰｓＰＬ１蛋白信号肽具有分泌功能；ｑＲＴ－ＰＣＲ分析发现，Ｐ．．．

　采用3个pH值缓冲液,4个浓度甲基磺酸乙酯(EMS)溶液及6个时间处理,对小麦条锈菌夏孢子的诱变条件进行优化。结果表明,在室温条件下缓冲液pH值为7.0时,经0.03mol/LEMS溶液处理6～8min,小麦条锈菌条中27号小种夏孢子的死亡率达83.6%～85.8%,符合微生物诱变经验指数最佳诱变剂量的选择标准。不同毒性的小麦条锈菌生理小种对EMS的敏感性不同,且在离体培养条件下,毒性较弱小种的生活能力及抗逆能力明显强于毒性较强的小种。

【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋...

【目的】明确近年来我国小麦条锈菌主要小种及流行菌系的分子遗传关系。【方法】利用AFLP技术,对我国近年来小麦条锈菌(Puccinia striiformisf.sp.tritici)的主要流行菌系,特别是水源11类群进行了DNA指纹分析,并与毒性分析结果进行了比较。【结果】(1)小麦条锈菌流行菌系之间,无论是毒性特征还是DNA指纹特征,均存在丰富的遗传变异,但二者并不相关;(2)AFLP聚类分析显示,水源11类群的不同类型之间并没有很近的亲缘关系,其在遗传上不属于同一个来源。【结论】新出现的致病类型很可能由较近的共同起源菌系进化而来;AFLP技术非常适合于小麦条锈菌的遗传分析,能客观揭示小种(...