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[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
常立 李周岐 李煜 魏军坤 王淑惠
【目的】克隆杜仲黄酮醇合成酶基因(Fls)全长,对其开放阅读框(ORF)进行原核表达分析。【方法】以杜仲叶片为材料提取总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆杜仲Fls基因;Fls基因的ORF经限制性内切酶酶切,构建其原核表达载体pET-28a-Fls;最后利用IPTG诱导Fls基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。【结果】获得了黄酮醇合成酶基因全长序列,长度为1 220bp,ORF为1 011bp,编码336个氨基酸;成功构建了原核表达载体pET-28a-Fls;利用IPTG诱导Fls在BL21(DE3)中表达,SDS-PAGE电泳结果显...
关键词：
杜仲 基因克隆 Fls基因 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
李晨宇 足木热木·吐尔逊 李晓荣 杨洋 李波 于月华
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用，而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值，因此，从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列，并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析，通过Gataway BP和LR反应，将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上，通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件，最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示，GhMYB42(XP＿016732693.1)全长序列1 508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸，预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现，MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域，是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示，陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP＿012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显，因此，选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明，重组蛋白的大小正确，最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白，后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭亚格 刘佳隆 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2 221)H_(3 451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1 320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
丛凡淏 赵金乔 刘毅 杨竞平 张林波
【目的】克隆人生长分化因子－１５（Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔＨ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１５，Ｈｇｄｆ－１５）成熟肽基因，构建其原核表达载体，并进行诱导表达，为Ｈｇｄｆ－１５药理活性和生物学功能研究奠定基础。【方法】利用Ｐｃｒ技术克隆人Ｈｇｄｆ－１５成熟肽基因，将其连接到Ｐｅｔ－２８ａ载体上构建Ｐｅｔ－２８ａ－Ｈｇｄｆ－１５原核表达载体，并将此载体转入ｒｏｓｅｔｔａ（ｄｅ３）大肠杆菌感受态细胞，获得重组大肠杆菌，对目的蛋白分别采用不同温度（１６，２５，３７℃）、ｉＰｔｇ浓度（０．１０，０．２５，０．５０，０．７５，１．００ｍｍｏｌ／ｌ）和时间（１２，２４，３６，４８Ｈ）进行诱．．．
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王金苹 赵俊龙 江涛 周艳琴 刘琴 付媛 姚宝安
利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出SAGⅠ部分基因片段,亚克隆入表达载体pGEX-KG,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示表达的重组蛋白的分子量为56ku。免疫印记分析显示此表达产物能被猪抗弓形虫阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有免疫反应活性。为进一步进行弓形虫病的免疫预防和诊断研究奠定了基础。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王伟 白俊杰 劳海华 叶星 罗建仁
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87...
关键词：
草鱼 Mx蛋白基因 基因克隆 原核表达
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
胡薇 刘宁 田玉华 李雨婷 张连学
【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶(SQE)基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cD-NA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8mmol/L IPTG 37℃诱导表达4h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用Ni-Agarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS)检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 ...
关键词：
人参 鲨烯环氧酶 cDNA克隆 原核表达
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
谢丽雪 黄科 李宾 黄志伟 郑金贵
根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
宋廷宇 侯喜林 吴春燕 何启伟 霍雨猛
以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸。以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段。经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%。经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构。扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融...
关键词：
薹菜 CYP79B5 基因克隆 原核表达
[期刊] 中国农业科学
[作者]
宋杨 张艳敏 刘美艳 王传增 刘金 冯守千 王延玲 陈学森
【目的】克隆短枝型苹果(Malus domestica Borkh.)的MdRGL基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为明确短枝型苹果MdRGL基因与短枝芽变特性之间的关系奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以短枝型苹果叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得短枝型苹果MdRGL的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。将克隆到的短枝型苹果MdRGL克隆到表达载体pGEX-4T-1上,构建融合表达载体pGEX-4T-MdRGL,转化到大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。【结果】从短枝型苹果中克隆到5条MdRGL基因:MdRGL1a/b、MdR...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李彬 毛立 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良...
关键词：
猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
邓淑贞 王斌 高磊 牛倩雅 刘涛 翁曼丽 郭宝太
以叶状体总DNA为模板,用3对DNA引物进行PCR扩增,获得了坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PhTPS)3个重叠的片段,大小分别为1.3,1.1,0.7 kb。用pMD18-T载体克隆这些片段,经测序与序列拼接获得了该基因完整的ORF序列,其长度为2 727 bp。在已经构建条斑紫菜TPS基因原核表达载体pET22b-PyTPS的基础上,用PhTPS基因替代该表达载体中的PyTPS基因,获得了PhTPS基因的原核表达载体pET22b-PhTPS。重组菌BL21(pET22b-PhTPS)经IPTG诱导,SDS-PAGE显示获得了约100 kDa的特异性蛋白条带;目测及OD600的测定结果表明...
[期刊] 华北农学报
[作者]
张志远 张继希 徐红运 刘肖萍 卢晓艳 段二珍 夏平安 崔保安
应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
孔祎頔 田佳鑫 赵林辉 陈秀梅 单晓枫 王桂芹
【目的】克隆维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)低钙反应蛋白(AcrV)并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行EcoRⅤ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度(0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L)和诱导时间(2,3,4和5 h)进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。
[期刊] 华北农学报
[作者]
任瑛 赵美爱 郭新梅 裴玉贺 宋希云
为了研究冷胁迫处理下的玉米抗坏血酸过氧化物酶的作用,根据GenBank发表的APX基因的ORF序列设计引物,利用RT-PCR从冷胁迫后的玉米自交系(E28)叶片总RNA中经cDNA转化,pMD19-T载体的亚克隆,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基。生物信息学分析显示,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.3 kDa和5.56。将携带完整的ORF序列连入表达载体pET-28a(+)中,APX基因经IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测到目标蛋白的大小约为27.3 kDa,与预测结果一致。抗盐分析显示,重组大肠杆菌BL21(pET28-APX)的抗...
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