【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)是蚕业上最常见且危害最为严重的病原微生物之一,其晚期表达因子(late expression factor,lef)LEF-11对病毒的增殖具有重要作用,相关研究证明LEF-11蛋白能够发生自身相互作用形成寡聚体,本研究通过逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的关键区域。【方法】利用双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation)技术和荧光定位(

采用RT-PCR方法从传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)中扩增RNA获得1 176 bp的核衣壳蛋白(N)基因,将其插入于pFB-LIC-Bse杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-N,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-N。再将其转染至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。IFA和Western Blot分析表明,重组N蛋白可以被辣根过氧化物酶(HRP)标记的组氨酸单抗(anti-His)识别,表明,IHNV N基因在昆虫细胞Sf9中获得了正确表达。为深入研究N蛋白的功能和免疫学特性奠定了基础。

为研制基于杆状病毒表达系统的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV)新型亚单位疫苗,将CGSIV主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因克隆至杆状病毒穿梭载体p Fast Bac1质粒中,构建了重组质粒p Fast Bac-MCP。转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经PCR筛选和测序获得了阳性重组杆粒r Bacmid-MCP,在昆虫细胞转染试剂介导下将该重组杆粒转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PR

为构建可溶性表达弓形虫MIC1蛋白质的重组杆状病毒株并分析重组蛋白质的活性，通过PCR扩增弓形虫mic1基因的编码序列并连接到pFastBac 1质粒中，将重组的转移质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒，转染Sf9细胞后连续培养3代获得重组杆状病毒株。结果显示，Sf9细胞在感染后的第3天出现典型的细胞病变；间接免疫荧光和Western blot试验结果表明MIC1重组蛋白质在感染的Sf9细胞中成功可溶性表达；纯化的MIC1重组蛋白质不仅具有结合唾液酸乳糖的能力，同时能够刺激Balb/c小鼠产生较高水平的特异性抗体（>1∶25 600）。以上结果表明，通过杆状病毒表达系统可获得具有生物学活性的弓形虫MIC1重组蛋白质。

【目的】研制以杆状病毒表面展示系统为基础的猪瘟基因工程亚单位疫苗。【方法】利用杆状病毒表面展示(Baculovirus display)技术,构建展示猪瘟病毒(CSFV)囊膜蛋白的重组杆状病毒BacSC-E0E1E2,该重组杆状病毒带有His6标签,且胞质区域(CTD)和跨膜区域(TM)均来源于杆状病毒囊膜蛋白gp64的CTD和TM。对重组杆状病毒进行Western blot分析、激光共聚焦显微镜观察、免疫金电子显微镜检测、动物免疫试验、血清中和试验。【结果】Western blot分析结果表明,重组杆状病毒中表达了重组E0E1E2蛋白;激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞S...

寨卡病毒(Zika Virus)属于黄病毒科中的黄病毒属,虽然很早就已经被人类所发现,但是一直到2015年在南美巴西的大规模爆发,才引起了广泛的关注.寨卡病毒对人类的感染往往引起包括小头畸形和格林-巴利综合征在内的多种症状.寨卡病毒的基因组为单链正链RNA,其基因组可以编码翻译并剪切加工出3个结构蛋白,分别为膜蛋白,囊膜蛋白和核衣壳蛋白,以及7个非结构蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5).相关研究已经证明,NS1蛋白与同属黄病毒属的登革病毒的发病有紧密的联系,而且根据其蛋白结构推测其可能与寨卡病毒穿越血脑屏障有关.因此鉴别NS1与细胞内的相互作用蛋白对于发现寨卡病毒在细胞内的转运,转录,以及装配都有重大的意义.在此,该课题构建并在HEK293细胞中表达包含Flag和Strep两种标签的NS1融合蛋白,通过免疫沉淀的方法将与NS1结合的蛋白利用标签蛋白进行分离,利用高分辨生物质谱技术,对蛋白进行分析鉴定.通过分别带有Flag与Strep标签的相互作用蛋白分析,发现了16个两种标签共同的结合蛋白,其进一步的通路分析证明这些蛋白于与病毒转录、病毒复制和免疫反应多个通路有关,相关的研究结果为今后进一步研究寨卡病毒的复制机制以及开发抗病毒药物提供了重要的参考价值.

【目的】非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种严重危害猪养殖业的急性烈性传染病。【方法】为了制备特异性强、敏感性高的ASFV血清学诊断用抗原,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了ASFV P30-54融合蛋白基因。将P30-54融合蛋白基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBac1中,构建重组质粒pFastBac-P30-54;将重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌进行重组,经抗性与蓝白斑筛选得到杆状病毒重组质粒Bacmid-P30-54;将reBacmid-P30-54转染sf9细胞,获得重组杆状病毒reAcMNPV-P30-54。将获得的reAcMNPV-P30-54接种sf9细胞,待细胞出现CPE时收集细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)和SDS-PAGE进行分析重组蛋白的表达情况;通过Western blot检测重组蛋白的反应原性。【结果】在重组杆状病毒中成功表达P30-54蛋白,该重组蛋白可与ASFV多克隆抗体发生免疫学反应。【结论】证实该重组蛋白具有良好的反应原性。

为了获得具有标记的猪瘟病毒Erns蛋白,通过基因工程操作,使猪瘟病毒Erns基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中高效表达了ErnsGFP融合蛋白,经Western Blot和荧光显微镜观察证实,表达产物分子量正确,且发出易于检测的绿色荧光,具有标记的Erns蛋白的获得为进一步研究Erns蛋白结构和功能奠定了基础。

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组p...

为研究Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外纤维蛋白ＶＰ５６与宿主蛋白的相互作用，实验采用酵母双杂交Ｇａｌ４系统鉴定与ＶＰ５６相互作用的草鱼蛋白。首先利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从Ⅱ型ＧＣＲＶ感染的草鱼肾细胞中扩增目的基因ＶＰ５６，构建Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６诱饵表达载体；在酵母菌株中检测其自激活性后，以ＶＰ５６为诱饵在草鱼酵母双杂交文库中筛选阳性菌株，并对阳性克隆的序列进行分析。实验也克隆了草鱼ＪａＭ－ａ（ＧＣ ＪａＭ－ａ）基因，并构建Ｐ ＧａＤＴ７－ＧＣ ＪａＭ－ａ载体，在酵母中研究草鱼ＧＣ ＪａＭ－ａ与病毒蛋白ＶＰ５６相互作用的可能性。研究表明构建的诱饵质粒Ｐ ＧＢＫＴ７－ＶＰ５６无自激活作用，可以应用于酵母双杂．．．

应用超薄切片技术，研究班节对虾卵细胞和各变态期病毒及其包涵体的分布和超微结构。在糠虾前期各期未找到病毒，而糠虾后期各期的肝和中肠上皮细胞核中则有典型的病毒及其包涵体存在。这提示着ＭＢＶ可能不经由卵细胞传播给子代。病毒粒子单个散在于核质和包涵体基质中，一端钝圆，另一端稍尖，形似葵花子，而不是如文献所言的长圆柱体，长度２７０—３００ｎｍ，直径平均７５ｎｍ，由囊膜、衣壳和核心三部分组成，囊膜上无纤突。这与文献上报道的斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）相仿，因此，所观察到的病毒应是ＭＢＶ。这表明ＭＢＶ分布地域波及我国大陆南方沿海。此外，作者所见的核衣壳是偏心位置，而非居中排列，并指出这有利于核衣壳更快进入靶细...

:以海捕中国对虾为材料 ,利用多聚酶链反应 (PCR)技术和核酸探针技术 ,对从中国对虾杆状病毒核酸随机文库中筛选的 4个片段 (大小分别为 80 0 ,1 1 0 0 ,1 5 0 0 ,2 5 0 0bp)用地高辛标记作为探针 ,进行斑点杂交 ,检测对虾杆状病毒。结果表明海捕中国对虾的鳃、中肠、肝胰腺、卵巢等组织检测为阳性 ,肌肉组织为阴性。实验表明中国对虾杆状病毒存在垂直传播的可能性

【目的】改进用于同源重组研究的制备杆状病毒DNA的方法。【方法】采用PCR方法从BmNPV中扩增出多角体基因,并在其两端引入Bsu36I酶切位点。将此片段克隆入转移载体pBacPAK8中,与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞,获得重组病毒。该病毒能形成多角体,便于纯化,同时可以被Bsu36I酶切。该重组病毒的多角体纯化后被裂解,并提取病毒DNA。病毒DNA经Bsu36I酶切后,与含gfp基因的转移质粒共转染家蚕BmN细胞,在荧光显微镜下观察重组病毒的转染效率。【结果】BmNPV多角体基因克隆入转移载体pBacPAK8中后,与线性化的AcPak6及BmPak6DNA共转染sf细胞及BmN细胞,...