为了解转基因家蚕在杂交转育和累代选育过程中,外源基因在基因组上的整合位点和拷贝数变化情况,通过反向PCR和southern杂交,测定外源基因在杂交一代和三代品系的拷贝数与插入位点。反向PCR结果显示,所有样品均只扩增出一条片段,且大小一致。对扩增片段进行克隆测序和比对发现,外源基因均系插入同一位点,位于24号染色体。Southern blotting试验结果表明各试验样品均得到了较好的一条杂交信号,而对照没有杂交信号,说明外源基因在各个样品中均系单拷贝插入,而且插入的位置没有随着转育和传代培养而发生变化。研究结果表明外源基因可稳定遗传,将此转基因材料与常规品种材料进行杂交,选育优良家蚕品种的方...

【目的】本研究是从前期获得的100余份转基因抗除草剂草甘膦玉米品系中,挑选T抗-1等14个转基因玉米品系进行拷贝数检测。【方法】采用一种新型的拷贝数分析方法——微滴数字PCR技术(droplet digital PCR,简称dd PCR),设计特异引物对外源抗草甘膦基因2m G2-epsps进行绝对定量分析。【结果】供试的14份转基因材料中10份是单拷贝品系。同时,通过引物探针特异性试验、叶片基因组DNA的PCR抑制和浓度检测、转基因玉米的外源基因2m G2-epsps的实时PCR检测和基因组DNA的酶切

本研究以台湾褐色菜鸭为试验动物，采用荧光定量ＰＣＲ技术，使用２－ΔΔＣｔ换算法对ＰＲＬＲ基因拷贝数进行定量，分析了其多态性与台湾褐色菜鸭生产性能的相关性．结果表明，ＰＲＬＲ和Ｌｄｈ－Ｂ标准曲线的Ｒ２分别为０．９９１和０．９９０，扩增效率分别为１１１．６８％和１０８．４２９％，斜率分别为－３．０７０和－３．１３５，ＰＲＬＲ和Ｌｄｈ－Ｂ的扩增效率近似一致，可通过２－ΔΔＣｔ方法对ＰＲＬＲ基因进行定量分析．在９４羽台湾褐色菜鸭的样品中共检测到５种拷贝数（１、２、３、４、５）变异类型，拷贝数变异与台湾褐色菜鸭的蛋壳厚度和蛋形指数显著相关（Ｐ＜０．０５），拷贝数为２的个体蛋壳厚度显著高于拷贝数为１和５的．．．

为鉴定抗除草剂转基因大豆新品种‘GE-J12’的外源基因插入拷贝数,以该转化体的外源插入目的基因G2-EPSPS和GAT的序列、3′转化体特异性序列为靶序列,设计PCR扩增引物和TaqMan探针,并对引物探针特异性进行鉴定,同时以大豆内标基因Lectin为参照,建立微滴数字PCR拷贝数检测体系。特异性试验结果显示,只有以抗除草剂转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板才有扩增信号。以单株转基因大豆‘GE-J12’基因组DNA为模板,进行外源目的基因G2-EPSPS和GAT、3′转化体特异性序列的微滴数字PCR检测,转基因大豆‘GE-J12’的外源目的基因G2-EPSPS和GAT在基因组上的插入拷贝数均值分别为0.99和1.01。同时3′转化体特异性序列的拷贝数均值为1.00,验证单株转基因大豆‘GE-J12’为纯合子,因此鉴定该单株转基因大豆‘GE-J12’的外源基因在大豆基因组上为单拷贝插入,同时与Southern blot方法进行比较,结果一致。

对转入多拷贝rolB、rolC基因的三倍体毛白杨进行高生长量、生根率和内源激素(IAA、ABA)含量等指标的测定,以研究多拷贝rol基因在转基因植物中的表达。结果显示:转Ri质粒三倍体毛白杨再次分别转入rolB、rolC基因后,部分株系试管苗的生长受到了抑制,但各株系生根率均有不同程度提高;rolB基因转化植株的内源IAA平均含量高于rolC基因转化植株,其IAA/ABA值亦高于rolC基因转化植株。试验结果表明rol基因的多拷贝促使转化植株快速大量生成毛状根。

拷贝数变异(Copy number variation,CNV)是一种重要的基因组结构变异,主要指从几kb到数个Mb范围内DNA的多态,包括片段插入、缺失、重复等,它是研究基因组进化和表型差异的重要因素。CNV最早在人类基因组上发现,近几年,在鼠、猪、牛等动物基因组上的研究也取得了明显成效。文章阐述了生物遗传变异的2种方式CNV和单核苷酸多态性,对CNV的形成机制和检测方法进行了分析,重点介绍了畜禽基因组CNV的研究现状,并就CNV未来的研究重点和需要解决的问题进行了展望。

基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)平台,以转基因玉米为例,建立了转基因作物(Genetically modified crops,GM crops)外源基因拷贝数分析方法,对待测样品进行了快速鉴定,并从T_0转基因玉米株系中鉴定出多个单拷贝单株。对该方法与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法在分析结果的准确性方面进行了比较,从试验数据可以看出,2种检测方法的结果比较一致,单拷贝检测结果高度一致;但是ddPCR

【目的】探索中间锦鸡儿基因组中FAD2基因的拷贝数,分析不同拷贝的表达模式,以期揭示不同拷贝在植物体内的功能分工。【方法】根据中间锦鸡儿(Caragana intermedia)FAD2基因的保守序列设计1对引物SF和SR,利用该引物对PCR扩增制备114 bp的Southern检测探针,探针进行地高辛标记后,采用罗氏Southern杂交试剂盒进行Southern检测。根据中间锦鸡儿3个FAD2基因各自的特异差异序列,分别设计定量PCR引物序列,以actin基因为内参,对中间锦鸡儿的根、茎、叶及不同发育时期(发芽15,25,35 d)种子的cDNA进行定量PCR分析。【结果】中间锦鸡儿FAD2...

【背景】许多研究报道拷贝数变异（copy number variation, CNV）是一种长度在50 bp至5 Mb之间的缺失或插入，可以影响基因的表达，从而影响动物的生长发育特征，与畜禽重要经济性状有紧密的关联，是一种重要分子遗传标记之一。狮头鹅是世界体型最大鹅种之一，原产地为广东饶平，为广东卤鹅的原材料。但是，至今还没有关于狮头鹅CNV与体重体尺的全基因组关联研究报道。【目的】通过二代基因组测序数据鉴别狮头鹅的CNV和拷贝数变异区域（copy number variation region, CNVR）在基因组上分布情况，通过CNV与体重体尺性状的关联分析，挖掘显著影响体重体尺的CNV及候选基因，为狮头鹅后续的分子育种研究提供参考。【方法】试验共收集了来自汕头市白沙禽畜原种研究所的111只狮头鹅，其中公鹅20只，母鹅91只。所有鹅均采用统一标准饲养管理。对111只鹅进行体重体尺测定，体尺性状包括体斜长、胸深、胸宽等9个指标。本试验对111只鹅进行体重体尺测定和二代基因组测序（5×）。测序数据利用SOAPnuke进行质控，软件Speedseq中的BWA模块进行序列比对，采用Speedseq中的LUMPY和CNVnator模块检测结构变异（structure variation,SV），从SV中筛选CNV。本试验用软件SVtools对CNV进行基因分型，然后采用单标记混合模型开展分型CNV与体重体尺的关联分析。采用染色体显著性水平（即0.05/染色体CNV数目）作为定义与性状显著关联CNV的阈值，对显著CNV位点及上下游50 kb进行基因注释，找到影响狮头鹅体重体尺关联的候选基因。用R包CNVrd2对物理距离小于1 Mb的染色体水平显著CNV和染色体水平显著SNP做连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）分析。【结果】对于111只狮头鹅，共检测出99 158个CNV，其中缺失型94 560个，重复型4 598个，CNV平均长度11 858 bp,大部分（74.06%）CNV长度位于50—1 000 bp区间。CNVR共5 225个，包括缺失型5 029个，重复型110个和混合型86个，CNVR平均长度为7 136 bp,大部分（81.03%）CNVR长度位于50—1 000 bp区间。功能注释发现46.92%CNVR位于基因间区域，10.30%位于基因上游，9.35%位于基因下游。准确进行基因分型的CNV有6 217个，通过10个体重体尺性状与这些CNV关联分析，共检测55个染色体显著性水平的CNV位点，注释到45个候选基因。在45个候选基因中，发现SETD2、UBR7、G2E3等10个基因同时影响两个及两个以上性状。染色体水平显著CNV独立于染色体水平显著SNP影响体重体尺性状（r2<0.02）。【结论】通过二代基因组测序首次报道狮头鹅基因组CNV和CNVR分布及CNV和体重体尺关联的情况。本试验共发现影响体重体尺的45个候选基因，其中11个已被报道与畜禽生长信号通路有关，分别是SETD2、UBR7、ASB1和HDAC4参与肌肉的增殖、分化和代谢；G2E3、P3C2B、NOVA1和PDE1B参与脂肪生成和肥胖；ILKAP与调节生长因子有关；KIF1B参与骨代谢；ZFP37参与糖原代谢。这些为后续狮头鹅生长性能的分子遗传机制解析和分子标记挖掘奠定基础。

为了探讨刀鲚２种不同生活史种群的遗传结构差异以及成因，本研究利用分子克隆及转座子展示技术，从刀鲚基因组中分离、鉴定出一类新的、命名为Ｃｎ－ＴＣ１的转座子。该转座子全长１８９６ ｂｐ，为鳀科鱼类第一类被挖掘的ＴＣ１转座子。Ｃｎ－ＴＣ１自身包含另一个长度为１０４０ ｂｐ的类ＴＣ１，表明Ｃｎ－ＴＣ１在基因组内的转座经历过多次迸发。Ｃｎ－ＴＣ１的５’和３’末端反向重复序列长度分别为６４和８３ ｂｐ，转座插入位点具有＂ＴＡＴＡ＂基序。预测的Ｃｎ－ＴＣ１转座酶具有与ＤｎＡ结合的保守结构，提示其仍具有转座潜能。Ｃｎ－ＴＣ１插入位点侧翼序列的ＧＣ含量呈不均匀分布，均值低于ＡＴ含量。运用荧光定量ｐＣＲ方法，估算．．．

采用PCR和Western-blot方法,研究了储藏过程中不同温度(4、25和37℃)和不同时间(10、30、50、70和90 d)对转基因大豆外源cp4-epsps基因和EPSPS蛋白的影响。结果表明:在储藏过程中外源cp4-epsps基因没有发生明显变化;外源EP-SPS蛋白发生轻微降解,降解产物相对分子质量约为46.2×103,而且37℃降解条带较25℃明显,说明相对较高的温度(25和37℃)在储藏90 d期间能够促进外源EPSPS蛋白的降解,而对基因完整性影响较小。

为了解脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)在不同发育期线粒体基因组(mtDNA)拷贝数的变化特征,本研究共采集其8个时期(受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期)的DNA样品,利用TaqMan实时荧光定量PCR技术,对上述各发育期单个细胞中的mtDNA拷贝数进行了测定。检测结果显示,脊尾白虾受精卵期、溞状幼体Ⅰ期、溞状幼体Ⅱ期、溞状幼体Ⅲ期、溞状幼体Ⅳ期、溞状幼体Ⅴ期、仔虾期和成虾期的mtDNA拷贝数的均值分别为2366、2648、2644、2873、3559、9948、6452和8872。进一步统计分析结果显示,mtDNA拷贝数与发育时间存在正相关性,相关系数为0.83。研究表明,随着脊尾白虾不断生长,其单个细胞中mtDNA拷贝数总体呈上升趋势。

转基因植物的遗传稳定性分析是基因工程的重要环节。本研究以转基因白桦的控制授粉杂交子代家系、正反交子代家系以及自由授粉的半同胞子代家系为研究对象，测定了各家系间的种子千粒质量、发芽率、发芽势以及活力指数。结果表明：各家系间种子千粒质量及种子活力等指标差异达到极显著水平（Ｐ＜０．０１），各性状的变异系数在４１．０９％～７３．１６％之间，遗传力在９８．００％以上；种子千粒质量与发芽率、发芽势、活力指数呈极显著正相关，相关系数分别为０．９１６、０．８０３与０．８９６。转基因株系与非转基因株系正反交群体的外源基因检测表明：外源基因通过雌配子的传递效率高于雄配子，雌、雄配子外源基因传递效率分别在６０．００．．．

以转基因马铃薯株系为材料，采用Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ方法，以ＳＹＢＲ ＧＲｅｅｎ ｉ为荧光染料，以马铃薯块茎贮藏蛋白基因（Ｐａｔａｔｉｎ）作为内参基因，以植物表达载体上的潮霉素抗性基因（ＨＰｔ）为筛选标记基因，建立目的基因Ｃｔ值与起始模版的相关性标准曲线，通过实时荧光定量ＰＣＲ分别获得每个样品中内参基因和外源基因的Ｃｔ值，根据Ｐｆａｆｆｌ法计算获得了ｔ－Ｄｎａ在转基因马铃薯中的拷贝数，且与ＳｏｕｔＨｅＲｎ Ｂｌｏｔ方法进行了比较，并结合田间农艺性状，分析了外源基因拷贝数马铃薯株高及薯块产量的影响。结果表明，内参基因和外源基因标准曲线的相关系数分别为Ｒ２＝０．９９６、Ｒ２＝０．９９５和Ｒ２＝．．．

为测定爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)隐蔽质粒的拷贝数,并探究不同基因组制备方式及定量策略对质粒拷贝数测定的影响,分别采用试剂盒和水煮法制备爱德华氏菌基因组,通过绝对定量和相对定量PCR测定两种不同总DNA制备方式下的隐蔽质粒拷贝数,同时测定试剂盒对染色体DNA和质粒DNA的回收率。结果显示,以试剂盒提取的总DNA测得的pEI1和p EI2拷贝数绝对定量和相对定量分别为3.63±0.30、5.04±0.18和4.22±0.15、5.13±0.50,显著低于以水煮法测得的pEI1和p EI2拷贝数的绝对定量11.84±0.80、11.70±0.25和相对定量13.85±1.64、11.90±0.97。回收率结果显示,试剂盒对染色体DNA的回收率(45.8±4.1)%,显著高于对质粒pEII的回收率(25.1±0.5)%和pEI2的回收率(31.3±1.7)%。结果表明:通过实时定量PCR测定爱德华氏菌隐蔽质粒的拷贝数时,基因组的制备以水煮法为宜,爱德华氏菌隐蔽质粒pEI1和pEI2均属于中拷贝质粒。