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[期刊] 水产学报
[作者]
张杰 郭海杰 高丽婷 毛芝娟
杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,
[期刊] 水产学报
[作者]
王莹 汪浩 徐伟 汪玮 施慧 王庚申 谢建军 何杰 许文军
为评价大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C（GenBank：EPB97112.1）的免疫保护效果，通过原核表达获得重组的Tol C功能域蛋白，命名为B6。用兔抗杀香鱼假单胞菌多抗血清对B6进行免疫原性的初步检测。将B6与明矾佐剂混合制成亚单位疫苗，腹腔注射免疫大黄鱼，免疫4周后攻毒，检测相对保护率（relative percent survival，RPS）；同时，采集免疫后第2、4、6、8周的鱼血清和头肾、脾脏，测定血清抗体效价和免疫相关基因的表达变化；采集健康和攻毒后个体的头肾和脾脏，制成石蜡切片，观察组织病理变化。结果表明，B6分子量为22 ku。Western blot结果显示，杀香鱼假单胞菌兔抗血清与B6具有强结合条带。接种B6亚单位疫苗4周后，RPS达72.22%。ELISA结果显示，免疫后第2周起，血清抗体效价显著升高，第4周时达到峰值（log2 8.65），随后略有下降，第8周时降至log2 6.98。RT-PCR结果表明，免疫后第2、4、6、8周，头肾和脾脏中免疫相关基因均有不同程度的表达上调，其中IL-1β和MHC Ⅰ α的上调幅度最大，头肾中分别达到93.33倍和77.02倍，脾脏中分别达到241.13倍和131.95倍。除CD8外，IgM、IL-1β、CD4、MHC Ⅰ α、MHC Ⅱ β在脾脏中的表达上调幅度均高于头肾。石蜡切片显示，PBS对照组在攻毒后头肾和脾脏中出现严重的出血点和结节，并伴随不同程度的铁黄素沉积，B6免疫组在头肾和脾脏中仅有少量出血点，无结节和铁黄素沉积。综上，本研究对大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C进行了原核表达和免疫保护效果评价，结果表明B6具有良好的免疫原性，免疫后4周RPS达72.22%，具有作为亚单位候选疫苗的潜力。
[期刊] 水产学报
[作者]
杨西西 池洪树 郑在予 刘晓东 罗潘潘 许斌福 陈秀霞 龚晖
为建立大黄鱼肿大细胞病毒的培养方法，明确其分类地位，用肿大细胞病毒检测呈阳性的大黄鱼幼鱼病料（FD201807和SA201808）肾组织匀浆液感染鳜仔鱼细胞系（mandarin fish fry cell line-1，MFF-1）并连续传代，从病料组织匀浆液和细胞冻融液中提取病毒DNA，克隆病毒主要衣壳蛋白基因（mcp），测序后与NCBI Genebank中的虹彩病毒科肿大细胞病毒属病毒mcp以及2018—2020年所检出的15株大黄鱼肿大细胞病毒mcp进行比对分析。结果显示，病毒传至第4代才可引起MFF-1细胞病变，细胞病变的主要特征为细胞脱壁、变圆、折光度增强；感染时间越长脱壁细胞越多，同时培养液中的颗粒增加；透射电镜下可见感染细胞的细胞质散在大小为130～150 nm的六边形病毒粒子和空壳。感染细胞的病变周期随传代代次的增加而缩短，第15代次的FD201807株感染细胞80%细胞病变的时间为3 d，第15代次的SA201808株感染细胞80%细胞病变的时间为7～8 d。mcp序列比对和聚类分析发现SA201808株和FD201807株为虹彩病毒科、肿大细胞病毒属的不同病毒，SA201808株与FD201807株的mcp序列存在21个碱基差异，二者的mcp序列分别与大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus， LYCIV)LYCIV-Zhoushan（GenBank: MW139932.1）和花鲈虹彩病毒（Lateolabrax maculatus iridovirus， LMIV）（GenBank: MH577517.1）相近。15株从大黄鱼病料检出的病毒中，12株的mcp序列与SA201808株聚类；3株与FD201807聚类。本研究首次利用MFF-1细胞系分离培养了大黄鱼肿大细胞病毒，揭示了大黄鱼肿大细胞病毒存在差异，为更好地了解大黄鱼肿大细胞病毒提供了数据参考。
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
张家莉 潘永 段世宇 令狐远凤 郑如雯 杨琦
细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控，利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株，在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株，通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示：与标准菌株相比，gcvB缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调；prgJ、prgK的转录水平上调，蛋白水平下调。hfq缺失后，spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调，prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。
[期刊] 华北农学报
[作者]
李淼 李春玲 宋帅 杨冬霞 蔡汝健 李艳 蒋智勇 勾红潮 楚品品
分泌型核酸酶基因ssnA是近年来研究发现的一种脱氧核糖核酸酶,被认为是一种猪链球菌2型(SS2)潜在的毒力因子。为了分析ssnA基因对于SS2毒力的影响,通过体外构建具有同源臂的重组自杀性质粒,电转化进入SS2,经同源重组构建了SS2流行毒力株GD01的ssnA基因缺失突变菌株,并通过比较分析了野生菌株与缺失突变菌株的生长特性及溶血活性等生物学特性。结果显示,GD01株与ΔssnA突变株的生长速度及溶血活性没有明显差异;ssnA基因缺失后SS2对Hep-2细胞的黏附及入侵能力则明显下降。小鼠毒力试验结果显
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
李明云 张祖兴 邬勇 陈炯 史雨红
根据已报道的HSP基因序列(EMB登录号:AF506290),设计出特异引物,PCR扩增后测序,获得1.7 kb大小的大黄鱼热激蛋白cDNA基因序列。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明:不同物种编码的HSP存在一些明显相关的群体,高等动物编码的HSP在进化上紧密相关,形成一个显著群体,大黄鱼编码的HSP蛋白位于高等动物群体中,这与大黄鱼的亲缘关系大致吻合,其中与非洲爪蟾的同源性最高(92.3%),也间接印证了脊椎动物中两栖纲动物与鱼纲动物的亲源关系。通过大黄鱼HSP基因的提取和分析,可为以后制备出核酸探针、筛选和克隆出一批具有优良性状的基因、构建基因文库等研究工作奠定基础,同时对大黄鱼的品质改...
关键词：
大黄鱼 热激蛋白cDNA 克隆 系统发育
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
马水燕 王楠楠 董雨豪 刘锦 陆承平 刘永杰
#N/A
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
马小娟 韦小敏 来航线 房艳华 胡轶伦
【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，构建斜卧青霉转录调控蛋白Ｈａｃ１激活形式基因（Ｈａｃ１ｉ）随机插入过表达菌株和非激活形式基因（Ｈａｃ１ｕ）原位插入过表达菌株，并初步观察Ｈａｃ１基因的２种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况，为进一步研究转录调控蛋白Ｈａｃ１的功能奠定基础。【方法】分别克隆ｐｔｒａ筛选标记、ｇｐｄａ启动子、Ｈａｃ１ｉ编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子，利用融合ｐｃｒ融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｉ随机插入表达盒；再分别克隆Ｈａｃ１上游臂及编码区、ｅｇＦｐ编码区及终止子、ｐｔｒａ筛选标记、Ｈａｃ１下游臂序列，融合克隆片段，构建Ｈａｃ１ｕ原位插入表达盒。将２种表达盒分别转化斜卧青霉原生质．．．
关键词：
斜卧青霉 荧光蛋白 转录调控蛋白Hac1
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
董玉慧 罗力嘉 李梦莹 欧喜超 刘春法 范伟兴 赵雁林 周向梅
为了解我国新疆地区牛分枝杆菌的毒力基因变异情况并初步评估其毒力变化,利用聚合酶链式反应(PCR)检测临床分离的66株牛分枝杆菌的29个毒力基因,经Sanger测序后与标准株AF2122/97和本实验室保存的两株牛分枝杆菌(M.bovis C68004和M.bovis N)进行序列比对,对基因突变情况进行统计,分析基因突变对其编码蛋白功能和结构的影响。结果表明:1)临床分离株与本实验室保存的高毒力菌株M.bovis N毒力基因突变位点具有很高的相似性,在检测的29个毒力基因中,50%以上临床分离株与M.bovis N共有25个基因序列一致;2)临床分离株广泛存在的Mb2958、Mb2982C和Mb1553C基因突变PROVEAN评分均低于-2.5,可能改变其编码的酶催化活性,进而影响细胞壁脂类合成;3)Mb0607、Mb0609、Mb0606、Mb2979C和Mb1214基因突变分别造成哺乳动物细胞入侵蛋白、甲基转移酶和酰基转移酶蛋白二级结构改变,或许对细菌的胞内生存产生影响。综上,本研究筛选出8个关键毒力基因,这些基因的突变可能在新疆地区牛分枝杆菌流行菌株的毒力变化中发挥重要作用;同时,本研究揭示了关键毒力基因的突变特征,为进一步研究牛分枝杆菌遗传多样性及进化规律奠定了基础。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
张小琼 林拥军
以改造合成的5个Bt基因(cry1C*、cry2A*、cry1Ab、cry1Ac和cry9C*)为材料,利用DNAshuff-ling的体外分子进化技术构建1个含有1 000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库;通过诱导表达重组蛋白,ELISA方法测定蛋白表达量,以棉铃虫(Helicoverpa armigera)为试验昆虫进行毒性试验。结果显示:重组克隆的蛋白毒性与阳性对照Cry1Ac相比,增强的有122个,持平的有38个,有毒性但毒性降低的有232个,失去毒性的有608个;对这1 000个重组克隆进行了测序,比较了重组基因与原始基因的序列同源性,除去55个克隆未能找到其原始基因来源,将其余的94...
[期刊] 海洋水产研究
[作者]
沈锦玉 余旭平 潘晓艺 许文军 尹文林 曹铮
浙江宁波、台州等地相继发生网箱养殖大黄鱼的大量死亡,主要症状为脾脏、肾脏有许多白色结节,大小为0.1～1mm。从病鱼体内分离出致病力极强的菌株GYCWS,人工感染试验证实为大黄鱼的病原菌,其半数致死量(LD50)为8.5×104CFU/ml。对该细菌进行了形态、生理生化特性的测定,并进行了全自动微生物分析系统(ID32GN)及16S rRNA分子鉴定。经PCR扩增获得了大小约1.5Kb的16S rRNA部分基因片段,产物经回收纯化,克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌TG1,对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定确认阳性重组质粒,将测定的序列递交NCBI进行BLAST同源序列比对,与恶臭假单胞菌的...
[期刊] 水产学报
[作者]
刘峰 麦康森 艾庆辉 段青源 徐玮 谭北平 张文兵 马洪明 刘付志国
以初始体重(1.6±0.18)mg的大黄鱼(Pseudosciaena croceaRichardson)稚鱼(12日龄)为实验对象,在室内水族箱中进行为期30d的摄食生长实验。以白鱼粉为主要蛋白源,通过双酶水解制得鱼肉水解蛋白(FPH,粗蛋白72%),分别以鱼肉水解蛋白替代0%2、5%、50%和75%的鱼粉蛋白配制出4种等氮等能的实验微颗粒饲料,同时,以生物饵料(冷藏桡足类)为对照组,研究饲料中不同鱼肉水解蛋白对大黄鱼存活、生长以及体组成的影响。实验结果表明,当以FPH替代25%的鱼粉蛋白时,其存活率(32.6%)显著高于其余的各替代水平(P<0.05),但与生物饵料组(33.2%)之间差异...
[期刊] 水产学报
[作者]
邓素贞 韩兆方 陈小明 李庆昌 肖世俊 李佳凯 刘贤德
为了探究大黄鱼高温胁迫条件下基因表达水平的变化,实验利用Illumina Hiseq 2500的125 pair-ended测序模式分别对大黄鱼高温处理组和常温对照组进行了转录组测序。对照组(3个生物学重复)和高温处理组(3个生物学重复)分别获得15.28和13.92 Gb测序数据,GC含量平均值约为51%。过滤后的高质量测序reads使用Bowtie2软件比对到大黄鱼参考转录组序列上估计基因表达量,进而进行基因表达差异统计学检验。以常温对照组为参比,高温处理组中阈值设为|log2(FC)|>2和FDR
[期刊] 上海水产大学学报
[作者]
郭全友 许钟 杨宪时
对养殖大黄鱼5℃冷藏过程中品质变化特征及新鲜鱼、货架期终点时细菌相进行了定性和定量分析,用Gompertz方程定量描述了冷藏大黄鱼(Pseudosciaena crocea)细菌生长情况。新鲜大黄鱼菌落总数(TVC)为(5.52±0.41)log10cfu/g,挥发性盐基氮(TVBN)为(10.65±0.41)mg/100g,细菌相比较复杂,革兰氏阴性菌占84.3%,主要包括气单胞菌属(Aeromonasspp.)7.1%,不动杆菌属(Acinetobacterspp.)15.7%,弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)10.0%,假单胞菌属(Pseudomonasspp....
[期刊] 水产学报
[作者]
刘笋 王秀华 黄倢
从3株水产动物病原菌鳗弧菌MN、鳗弧菌3101、费氏弧菌培养液中分别获取了分泌性蛋白,进行SDS-PAGE,对表达量较高的5条蛋白区带进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明,它们分别是鳗弧菌MN金属蛋白酶(empA-MN)、鳗弧菌3101金属蛋白酶(empA-3101)、锌金属蛋白酶(zinc empA)、费氏弧菌VFMJ11_1094蛋白(VFMJ11_1094)和费氏弧菌ES114的外膜蛋白(OMP)。根据所鉴定的序列设计引物,分别从鳗弧菌MN、鳗弧菌3101和费氏弧菌中扩增出相应基因,克隆后测定emp-MN、empA-3101、zinc empA、VFMJ11-1094和OMP相应基...
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