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[期刊] 华北农学报
[作者]
臧大康 郑桂玲 周洪旭 张媛 李国勋 李长友
以本实验室分离的Bt菌株B-DLL质粒DNA为模板,利用cry8类基因特异性引物JJX5和JJX3扩增出3.5kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD 18-T中,筛选获得一个含新基因的克隆pMD-cry8new。序列测定表明,该基因编码区为3 525 bp,编码的蛋白质由1 174个氨基酸残基组成,理论分子量为133.05 kDa,等电点为pH4.69,为弱酸性蛋白。该基因核苷酸序列已在GenBank登录(Accession number:HQ174208),编码的氨基酸序列与Cry8Fa1的同源性最高达99.8%,被国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为Cry8Fa2。将cry8Fa2基因插...
[期刊] 华北农学报
[作者]
刘兴龙 程林友 李天龙 李长友 李国勋
根据已知Btcry8类基因的全长序列设计一对特异性引物JJX5和JJX3,以Bt菌株B-DLL的质粒DNA为模板扩增出3.5 kb大小的片段;将该片段插入大肠杆菌表达载体pET-21b中,并完成了该片段的全序列测定。该基因编码区为3 495 bp,编码的蛋白质由1 164个氨基酸残基组成,相对分子质量为131.8 kDa,等电点为pH 4.71,为弱酸性蛋白。该基因(GenBank:EU047597)编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性高达99.31%,被国际Bt基因命名委员会正式命名为cry8Ea2。经IPTG诱导后该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kDa...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
赵直 吴钢 王闵霞 朱旭东 蒲志刚 张志勇 彭正松 蔡平钟
以分离的3株苏云金芽孢杆菌质粒为模板,通过设计一对特异引物,PCR扩增得到3条全长3.6 kb的基因序列,其各自都包含一个完整的开放阅读框,编码序列全长分别是3468、3450、2697 bp(Genebank登录号分别为GQ385073,GQ385074,GQ385075);它们与cry1A类基因同源性都高达95%以上;分别编码1159、1150和902个氨基酸。并在此基础上采用生物信息学方法对这3个基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及功能域等方面进行了预测和分析。为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了基因来源。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
姜平 陈溥言 蔡宝祥
用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴＰＣＲ扩增出一１３２１ｂｐ的目的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体ＰＲＰＬ双强启动子的ｐＣＹＴＥＸＰ１表达质粒，构建了ＶＰ２基因克隆ｐＣＶＰ２１，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ筛选出４个ＶＰ２表达阳性克隆。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示有一约３２０００的目的蛋白带，且能与ＩＢＤＶ阳性血清结合。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
周晓梅 沈晋良 高聪芬
用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时...
[期刊] 华北农学报
[作者]
冯静静 郭巍 刘廷辉 孙永祥 孙伟明 徐大庆
克隆对鞘翅目害虫有毒力的B t新菌株GW S7的cry7Ab8基因,并对该基因进行表达和杀虫活性的研究。利用全长PCR方法克隆cry7Ab8基因,将cry7Ab8基因插入到表达载体pET28b,获得重组质粒pETcry7Ab8,转化E.coliBL21(DE3),诱导后表达130 kDa的蛋白。将cry7Ab8基因连接到大肠杆菌-苏云金杆菌的穿梭载体pSXY422b,获得重组穿梭质粒pScry7Ab8,电激转化到苏云金杆菌无晶体突变株HD73-(cry-),获得工程菌B ioHD7Ab8,表达蛋白后进行生物活性测定。生物活性测定结果显示Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫二龄幼虫有较强的杀虫活性,L...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
王清锋 喻子牛
利用ＰＣＲ片段延伸连接技术将ｃｒｙ１Ｅ的原启动子准确地更换为ｃｒｙ３Ａ启动子，重组ｃｒｙ１Ｅ经载体ｐＨＴ３１５克隆至枯草芽胞杆菌无芽胞突变株１Ｓ８和苏云金杆菌以色列亚种无晶体突变株４Ｑ７，获得重组菌３Ａ１ＥＢｓ和３Ａ１ＥＢｔ。聚丙稀酰胺凝胶电泳和生物测定表明，克隆改造后的ｃｒｙ１Ｅ可表达，表达的Ｃｒｙ１Ｅ对海灰翅夜蛾有毒（幼虫死亡率６０％～７０％）。
[期刊] 林业科学
[作者]
李长友 袁强 张永安 戴莲韵 黄大昉
利用苏云金芽孢杆菌cry基因的PCR RFLP鉴定体系和SDS PAGE方法分析了来自我国不同森林立地带土壤中的 72株苏云金芽孢杆菌的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I等 10类基因类型和表达蛋白 ,并进行了杀虫活性的生物测定。研究表明 :同时含有cry1,cry2 ,cry1I 3类基因的有 2 1株菌 ,6株菌含有cry1,cry2类基因 ,4株菌含有cry1和cry1I类基因 ,只含有cry1基因的有 1株 ,cry2类基因的 4株 ,36株菌不含所鉴定的 10类cry基因。同时证明 ,绝大多数含有cry1基因的菌株...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
刘京国 赵晓萌 杨爱珍 师光禄
【目的】构建含有α-胰凝乳蛋白酶作用位点的Cry3A的突变体Cry3Am,以期提高Cry3A的活化效率,增强杀虫活性。【方法】利用重叠PCR技术,构建Cry3A杀虫蛋白的突变体Cry3Am,使之在原核细胞中表达纯化突变体蛋白;将Cry3Am与饲料混合后饲喂黄粉虫,用以评价Cry3Am的杀虫活性。【结果】成功地在Cry3A杀虫蛋白结构域I的α3和α4之间加上1个α-胰凝乳蛋白酶的作用位点,并提取Cry3Am到杀虫蛋白。体外酶切试验结果表明,Cry3Am很容易地被降解为55 kD的杀虫蛋白。生测分析结果表明,Cry3Am对黄粉虫的毒力是Cry3A的2倍以上。【结论】向Cry3A中插入α-胰凝乳蛋白...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
张计育 渠慎春 薛华柏 高志红 郭忠仁 章镇
【目的】从湖北海棠叶片中克隆植物第Ⅲ类几丁质酶基因PR8的cDNA序列和基因组DNA序列,研究化学试剂SA、MeJA、ACC、ABA,非生物胁迫NaCl和低温(4℃),生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导下MhPR8基因的表达特性。【方法】利用PCR技术分别从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库和基因组DNA中克隆MhPR8基因全长序列;利用生物信息学方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因的表达特性。【结果】该基因编码区为897 bp,编码298个氨基酸,蛋白质分子量为31.67 kD,等电点为4.77,命名为MhPR8。该基因在其编码区内部没有内含子。M...
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
薛晶晶 陈松笔
采用RT-PCR方法,首次从木薯华南8号(SC8)克隆一个环指蛋白RFP基因家族成员MeRFP8.该基因c DNA包含1059 bp的开放阅读框,编码一个由352个氨基酸残基组成的蛋白质.该蛋白质分子质量为39.23 ku,理论等电点为4.84,C末端含有保守的结构域RING finger domain(Ring-H2 zinc finger),属于C3H2C3型环指蛋白.利用实时荧光定量PCR分析MeRFP8基因在木薯SC8及其同源四倍体叶片的表达水平,结果显示:5℃低温胁迫24 h内,SC8和其四倍体
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
蔡学忠 林矫娇 杨冠珍 施福恢 沈纬 蔡幼民 吴祥甫
以日本血吸虫 mRNA 为模板,用 RT-PCR 法快速克隆到一大小约600bp 的 DNA 片段,DNA 序列分析证实,所扩增到的 DNA 片段中含有日本血吸虫22.6kD 膜相关蛋白(Sj-22.6(Ch))基因,将该基因重组到表达型质粒 pGEX-4T 中,表达的 GST 融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂塘凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg·L~(-1)培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件.
[期刊] 西南农业学报
[作者]
王熙凤 乔军 孟庆玲 陈英 钟文强 贡莎莎 黄运福 才学鹏
【目的】为了研究肝片吸虫(Fh) SAP-2蛋白的反应原性及作为Fh血清学诊断抗原的潜力。【方法】本研究利用RT-PCR方法对Fh SAP-2基因进行扩增,将扩增产物克隆入p MD19-T载体后测序,对其进行分子特征分析;构建原核表达载体p ET-SAP-2,在E. coli BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行反应原性分析;以纯化的重组蛋白SAP-2(re SAP-2)为抗原,建立了检测Fh特异性抗体的间接ELISA,评估了SAP-2蛋白作为Fh血清学诊断抗原的潜力。【结果】Fh SAP-2基因全长306 bp,编码101个氨基酸。在线软件分析发现,SAP-2为疏水性、无跨膜区蛋白,信号肽位于第1～15个氨基酸之间。系统进化树分析表明,Fh SAP-2与曼氏裂体吸虫同源性最高,与其他寄生虫存在较大的差异。Western blot证实,re SAP-2蛋白可被Fh阳性血清特异性识别,有较强的反应原性。用re SAP-2蛋白建立了间接ELISA,对23份Fh阳性血清和10份阴性血清进行检测,结果证实re SAP-2蛋白有良好的特异性和敏感性。【结论】Fh SAP-2蛋白具有较强的反应原性,具有作为Fh血清学诊断抗原的潜力。
[期刊] 华北农学报
[作者]
杜立新 董明 王容燕 马铭泽 王金耀 曹伟平 宋健 冯书亮
苏云金芽孢杆菌SHJ-5菌株是从黑龙江采集的土样中分离获得的新菌株,对其伴孢晶体形状、基因型、蛋白表达以及杀虫活性进行了系统研究。菌株SHJ-5产生的伴孢晶体形状为钝菱形;利用PCR-RFLP技术对该菌株的基因型进行鉴定,结果表明,该菌株含有cry1Aa、cry1Ea、cry1Be、cry1Ah、cry1Ai、cry2Ab、cry1i和vip3A基因;SDS-PAGE晶体蛋白检测结果显示,该菌株表达130～150 kDa和60 kDa大小蛋白;生物活性测定表明,菌株SHJ-5对棉铃虫和小菜蛾有较高杀虫活性,校正死亡率分别为100%和96.7%。
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
郭燕 张彦明 高晨 韩俊 陈建明 石琦 高永军 周伟 董小平
为了研究微管相关蛋白2(M AP 2)在促进微管形成、维持微管稳定及促进轴突和树突细胞器转运等方面的作用,试验克隆了M AP 2微管结合区基因,构建了原核表达载体pET 32a-M AP 2并对其进行诱导表达,利用亲和层析法对表达产物进行纯化,研究了表达产物与微管蛋白之间的作用。结果表明,融合表达的人M AP 2微管结合区蛋白约43 ku,可与天然的微管蛋白发生分子间的结合作用,为M AP 2生理功能的研究奠定了基础。
关键词：
MAP2 表达纯化 微管蛋白
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