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[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
林健聪 孙悦 刘用垄 王锦达 王荣 张飞萍
【目的】氨肽酶N(APN)是昆虫中肠一类重要的Bt受体蛋白,Bt细菌产生的Cry毒素对昆虫的毒杀作用机理在学术界存在一定争议,但是普遍认为毒素与Bt受体蛋白的结合是产生毒力的必要环节。本研究通过基因克隆、生物信息学分析以及不同龄期组织中的表达对木毒蛾APN1基因进行研究,为后续研究APN基因家族、其他Bt受体蛋白及Cry毒素作用机制提供有益补充。【方法】以木毒蛾中肠cDNA为模板,对木毒蛾APN1基因进行克隆并进行生物学分析,利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析该基因在木毒蛾发育阶段及不同组织中的表达模式。【结果】克隆获得木毒蛾APN1基因的全长DNA,命名为LxAPN1。LxAPN1序列全长为3 159 bp,ORF为3 054 bp,编码1 017个氨基酸,序列比对和进化树分析表明,LxAPN1与舞毒蛾的LdAPN1高度同源,在N-端都具有信号肽,都具有锌结合位点HEXXH(X18)E以及保守区域GAMENWG,在末端具有GPI结合位点;LxAPN1在木毒蛾卵期无表达,在所有幼虫阶段中均有表达,幼虫期过后LxAPN1表达量锐减;LxAPN1在肠道的表达量明显高于头部和表皮。【结论】LxAPN1在木毒蛾中肠被成功克隆,LxAPN1与LdAPN1高度同源,并且在进化树的分布上也极其相近,推测两者的APN1功能上近似;LxAPN1在木毒蛾2龄幼虫期表达量最高。并且在6龄幼虫肠道中表达量最高,肠道高表达与LxAPN1作为Bt受体在木毒蛾中肠发挥作用息息相关。
关键词：
木毒蛾 Bt受体 氨肽酶N 克隆
[期刊] 湖南农业大学学报(自然科学版)
[作者]
问荣荣 王步勇 马玲
从舞毒蛾（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）３龄幼虫转录组文库中鉴定获得舞毒蛾谷胱甘肽ｓ–转移酶基因全长ｃ ｄｎａ，命名为Ｌｄ Ｇｓｔｅ１。该基因全长６５１ ｂｐ，编码２１６个氨基酸。序列分析显示，Ｌｄ Ｇｓｔｅ１蛋白氨基酸序列含有Ｇｓｔ＿ｃ＿ｄｅＬｔａ＿ｅｐｓｉＬｏｎ与Ｇｓｔ＿ｎ＿ｄｅＬｔａ＿ｅｐｓｉＬｏｎ ２个保守结构域，属于类硫氧还蛋白和谷胱甘肽ｓ–转移酶２个超家族。系统进化树分析表明，舞毒蛾Ｌｄ Ｇｓｔ蛋白属于Ｇｓｔ ｅｐｓｉＬｏｎ家族。蛋白结构显示，Ｌｄ Ｇｓｔｅ１蛋白包含一个ｎ端和一个ｃ端结构，α–螺旋与β–折叠为主要结构元件。实时荧光定量ｐｃｒ结果表明，在４．０、１０．０ ｍＧ／．．．
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王方昆 袁秀芳 王一成 张存 徐丽华 刘思当
【目的】对H9N2亚型猪流感病毒NS1(nonstructural protein1)基因进行原核表达,获得纯化表达产物,以期为检测猪流感抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增了猪流感病毒(H9N2)的NS1基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)上构建成重组质粒pET-NS1,转化受体菌E.coliBL21-DE3感受态细胞,经酶切鉴定及序列分析,筛选出正确重组质粒转化子。【结果】经终浓度5mmol·L-1乳糖诱导,SDS-PAGE电泳结果显示,重组蛋白NS1得到大量表达,分子质量约为26kD。经Western-blotting分析,表达蛋白能与阳性血清发生特...
关键词：
猪流感病毒 NS1基因 反应原性
[期刊] 中国农业科学
[作者]
常洪雷 梁革梅 王桂荣 于宏坤 吴孔明 郭予元
【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得...
关键词：
APN 杆状病毒表达载体 Tn 表达
[期刊] 西南农业学报
[作者]
张永福 徐仕琴 陈姣 杨砚斌 任禛
【目的】STOP1是植物耐铝毒的重要基因，为探明葡萄STOP1基因的结构特征及其表达量与其耐铝性的关系。【方法】以耐铝性弱的山葡萄(Vitis amurensis)和耐铝性强的小叶葡萄(V. sinocinerea)的叶片cDNA为模板，采用PCR和TA克隆技术获得VaSTOP1和VsSTOP1两基因序列，对其进行生物信息学分析和铝胁迫下的表达分析，并测定铝胁迫下的膜脂过氧化指标，对2个种STOP1基因的表达和膜脂过氧化物质的变化与耐铝性的关系进行比较。【结果】克隆获得的VaSTOP1和VsSTOP1基因序列长度分别为1 782和1 800 bp，分别编码594和600个氨基酸，相对分子量分别为67.03和67.48 kD，理论等电点为5.21和6.42；二者的二级结构中均有无规则卷曲>α-螺旋>折叠延伸链的规律，由α-螺旋、β-折叠片、β-转角和锌指结构等组成三级空间结构；进化树研究得出，VaSTOP1与VsSTOP1的同源性高达96%，二者与CcSTOP1、PnSTOP1、NtSTOP1、ErSTOP1的同源性均在80%以上。VaSTOP1基因表达量在铝胁迫28 d内呈先上升后下降的规律，较早出现峰值，而VsSTOP1基因表达量则稳定上升，这与二者的膜脂过氧化物质的变化规律基本一致。【结论】葡萄的耐铝性与其STOP1基因的表达量呈正相关，研究为进一步探明葡萄耐铝毒的分子调控机制提供了基因资源。
[期刊] 林业科学
[作者]
曹传旺 孙丽丽 问荣荣 豆晓洁 王志英
G蛋白偶联受体(GPCRs)是生物体内重要膜受体,通过激活三聚体G蛋白参与各种细胞内信号转导,在药物研发中具有重要的作用。从舞毒蛾无参照全转录本文库中鉴定获得GPCR家族中眼白化I型全长基因(命名为LdOA1),该基因全长453 bp,编码150个氨基酸,分子质量为17.54 kDa,理论等电点(pI)为9.76。进化树分析表明LdOA1蛋白与帝王蝶的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析表明舞毒蛾3龄幼虫在溴氰菊酯、甲萘威和氧化乐果胁迫下LdOA1的表达均表现为显著抑制。
关键词：
舞毒蛾 LdOA1基因 杀虫剂 基因表达
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
殷姗姗 李茂福 王华 李洋 张秋雷 金万梅 李天忠
为研究草莓中ＳＣＦ复合体的功能，以栽培草莓品种‘７４’为试材，采用同源克隆的方法分离出２个ＳＫＰ１基因。这２个基因核苷酸序列全长均为５１９ｂＰ，核苷酸序列相似性为９８．４６％，氨基酸序列相似性为９８．８４％，并具有特殊的‘ＧＶＤＥＤ’尾巴结构，分别命名为ＦａＳＫＰ１－１ａ和ＦａＳＫＰ１－１ｂ（基因登录号分别为ＫＵ９７５０５７和ＫＵ９７５０５８）。ＲＴ－ＰＣＲ和ＤＣａＰＳ分析发现ＦａＳＫＰ１－１ａ和ＦａＳＫＰ１－１ｂ在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达，在花瓣中表达量低。上述结果表明ＦａＳＫＰ１－１可能在草莓ＳＣＦ复合体的形成过程中发挥重要作用。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
敖冬慧 胡云飞 向贵生 刘佳 聂石圆 田洋 唐卿雁
【目的】鉴定辣木中MoGAD基因，并对其进行克隆、生物信息学分析和表达水平分析，为探究辣木MoGAD基因的功能与γ-氨基丁酸（GABA）生物合成的关系奠定了基础。【方法】以拟南芥（NP＿197235.1）和葡萄（XP＿002285268.1）GAD蛋白序列为参考，通过本地BLAST方法，利用TBtools软件在辣木转录组数据中挖掘MoGAD家族基因，采用PCR技术对其进行克隆，并通过生物信息学在线分析网站和分子对接技术分析MoGAD蛋白的理化性质和催化活性位点，采用实时荧光定量RT-qPCR技术分析MoGAD基因在不同组织中的表达水平。【结果】在转录组数据中挖掘到4个MoGAD基因并成功对其进行克隆，测序的CDS区长度分别为：1494 bp、1212 bp、1470 bp和942 bp；MoGAD1、MoGAD3和MoGAD4蛋白不存在跨膜结构域，属于膜外蛋白。其中MoGAD2蛋白序列在第5～27和60～82氨基酸位置存在跨膜结构，此段序列编码蛋白为分泌蛋白；系统发育分析显示MoGAD1基因家族所在分枝基因Motif数量最多；分子对接表明4个MoGAD蛋白存在磷酸吡哆醛（PLP）和L-谷氨酸结合位点，且每个蛋白有多个氨基酸残基与PLP，L-谷氨酸形成氢键；荧光定量分析显示MoGAD1和MoGAD2基因在嫩叶、成熟叶和花中的表达量显著高于MoGAD3和MoGAD4基因，但这些基因在茎中表达量较低，推测MoGAD酶主要参与辣木叶部位GABA的生物合成。【结论】文章成功克隆了辣木的MoGAD基因，并分析其编码蛋白的理化性质及与底物结合的功能活性位点，为进一步研究MoGAD基因的功能提供了理论依据。
[期刊] 林业科学
[作者]
苏烁烁 李明 吴鹏飞 张颖 马祥庆
【目的】PHT1基因家族是影响植物吸收磷营养的重要磷转运子之一。从杉木32号磷高效家系c DNA中克隆得到PHT1基因家族的1个杉木磷转运蛋白基因ClPht1;1,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;1的时空表达进行研究,为杉木PHT1基因序列特征和功能结构的研究以及磷高效利用杉木基因型的选育奠定基础。【方法】根据PHT1基因家族序列保守性设计简并引物,以32号磷高效杉木基因型根系c DNA为模板进行扩增获得目的基因ClPht1;1的c DNA序列,使用RACE技术对目的基因进行全长克隆,并对其序列特征、同
[期刊] 西南农业学报
[作者]
伍宝朵 胡丽松 范睿 杨建峰 郝朝运
【目的】克隆胡椒CBF1 (C-repeat-binding factor 1)基因,在低温耐受种质石南藤和低温敏感种质热引1号胡椒中,分析其组织表达模式和低温胁迫前后表达量差异,为胡椒抗寒分子机制研究提供基础。【方法】以胡椒组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增CBF1基因ORF,采用生物信息学软件分析CBF1基因编码蛋白特性和结构域,利用荧光定量PCR方法分析该基因的组织表达模式和低温胁迫条件下表达情况。【结果】在热引1号胡椒(低温敏感)和石南藤(低温耐受)中克隆出CBF1基因,分别命名为PnCBF1和PwCBF1。在2份种质中,该基因开放读码框长度分别为660和654 bp,预测蛋白质分子量分别为24.07和23.87kD,等电点PI为4.82。实时荧光定量PCR分析结果表明CBF1基因在石南藤的根组织中高量表达; CBF1基因在热引1号胡椒和石南藤中受低温诱导表达,且表达模式不同,低温胁迫各时期,CBF1基因石南藤的表达量都极显著高于热引1号胡椒。【结论】克隆获得PnCBF1和PwCBF1,其在热引1号胡椒和石南藤中都受低温诱导表达,在低温耐受种质石南藤中的表达量极显著高于低温敏感种质热引1号胡椒,且表达模式不同。本研究中胡椒CBF1基因的克隆和表达分析为胡椒CBF/DREB1低温调控途径研究和抗寒分子机制研究奠定了基础。
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
吕素慧 郗琳 聂静 温超 袁存权 马男 赵梁军
以切花菊‘神马’（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ‘Ｊｉｎｂａ’）为材料，利用ｒａＣｅ技术与同源克隆方法获得菊花ＣｍＰｉｎ１基因全长，通过ｑｒｔ－ＰＣｒ技术比较ＣｍＰｉｎ１在不同组织器官的表达，同时对ＣｍＰｉｎ１响应外施ｎａａ和去顶进行研究。结果表明：１）ＣｍＰｉｎ１基因ｏｒｆ全长１ ７６１ｂＰ，编码５８６个氨基酸，跨膜域位于蛋白ｎ端与Ｃ端；通过蛋白序列比对分析，菊花ＣｍＰｉｎ１蛋白与百日草ＺｖＰｉｎ１蛋白相似性最高；亚细胞定位结果显示ＣｍＰｉｎ１位于细胞膜；２）对ＣｍＰｉｎ１表达分析表明，该基因在菊花茎部与芽部具有相对较高的表达量，同时，在离体茎段中的ＣｍＰｉｎ１受到生长素诱．．．
[期刊] 草业科学
[作者]
王林杰 缪野 邹晓燕 邢玉芬 蒋凌雁 刘国道 陈志坚
植物的生长和发育受土壤磷有效性的影响。柱花草(Stylosanthes guianensis)是主要的热带豆科牧草，对低磷胁迫表现出优良的适应性。由LPR基因编码的多铜氧化酶被报道在调控植物根系生长和低磷响应方面发挥重要作用。本研究分析了低磷胁迫对两个柱花草基因型生长的影响，并对SgLPR1基因进行了克隆和表达分析。结果表明：相对柱花草基因型‘TF0285’，‘TF0277’具有较高的植株干重和磷吸收效率，且低磷处理促进了‘TF0277’根系的生长。基因克隆分析表明，SgLPR1基因全长为1 713 bp，编码570个氨基酸残基，蛋白分子量为64.1 kDa，属于Cupredoxin家族成员，亚细胞定位预测SgLPR1蛋白定位于内质网上。实时定量聚合酶链反应(PCR)结果表明，SgLPR1基因在柱花草茎中表达量高于其他组织中的表达量，且在根尖大于1 cm的根段中表达量最高。相比对照处理，缺氮、缺磷和缺钾处理均增加了SgLPR1基因在柱花草叶和根中的表达量。此外，低磷处理增加了SgLPR1基因在柱花草‘TF0277’根中的表达，但其在‘TF0285’根中的表达无显著变化。本研究结果揭示了SgLPR1可能参与柱花草根系生长对低磷胁迫的应答。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
陈玥 李家乐 沈玉帮
为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(gras...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王爱菊 唐金富 赵祥云 朱立煌
【目的】分离百合的LFY类基因,检测百合中LFY类基因的拷贝数并分析其表达模式。【方法】利用RT-PCR结合RACE的策略克隆百合的LFY类基因,通过Southern杂交检测百合中LFY类基因的拷贝数,通过RT-PCR分析LiLFY1基因的表达模式。【结果】获得了包括全长开放阅读框(ORF)的LiLFY1基因的cDNA序列。与已克隆的LFY类蛋白的同源性分析表明,LiLFY1编码的蛋白与单子叶植物水稻和玉米的LFY类蛋白具有更高的同源性。Southern杂交结果表明,二倍体百合中有2个拷贝的LFY类基因。LiLFY1基因在百合的幼嫩花芽和顶端分生组织中表达,而在根、茎、成熟的叶片和成熟花的各轮...
[期刊] 华北农学报
[作者]
李玉舒 杨炜茹 程堂仁 王佳 张启翔
ＳＯＣ１／ＴＭ３（ＳｕｐｐｒｅＳＳＯｒ Ｏｆ ＯｖｅｒｅｘｐｒｅＳＳｉＯｎ Ｏｆ ＣＯｎＳＴａｎＳ １／ＴＯＭａＴＯ ＭａＤＳ－ｂＯｘ ｇｅｎｅ ３）是ＭａＤＳ－ｂＯｘ家族一员，它能够整合多条开花途径的开花信号，调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花成花转变过程的分子机理，采用ｒＴ－ｐＣｒ的方法从梅花长蕊绿萼中克隆到３个ＳＯＣ１的同源基因，分别命名为ｐＭ ＳＯＣ１－１、ｐＭ ＳＯＣ１－２和ｐＭＳＯＣ１－３，并采用荧光定量ｐＣｒ对３个基因的表达模式进行了分析。序列分析表明，３个基因的编码区长度分别为６４５ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－１）、６５４ ｂｐ（ｐＭ ＳＯＣ１－２）和６６０ ｂｐ（ｐＭ．．．
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