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[期刊] 淡水渔业
[作者]
张涛 丁洁 张黎 刘莉 曹海军 王娟 顾继锐 伍翠芳 吴江 徐恒
在从患病大口鲇中分离到普通变形杆菌TWN-3株的基础上,将该菌总DNA用EcoRI不完全酶切后,分离5kb左右的片段,连接入pUC18质粒,转化E.coli BL21,构建基因组文库,得到3.6×103个重组子,远大于理论计算的1831个重组子,随机挑选重组子经EcoRI酶切鉴定重组率为100%,文库构建成功;将该菌裂解液与佐剂混合,免疫雄性新西兰大白兔,免疫程序结束后,抽血并分离血清,对用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后的文库进行免疫印迹筛选,最终得到8个阳性克隆子。本实验为该菌的DNA疫苗以及重要基因表达研究打下基础。
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
李林俐 朱来旭 张雪 费荣梅
[目的]为研究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的影响。[方法]在野生株XX2的基础上利用Red重组系统构建FliL基因缺失株和互补株。通过对野生株、FliL基因缺失株和互补株的生长曲线分析，探究FliL基因缺失对扬子鳄源普通变形杆菌生物学特性的相关影响；利用细菌具有周期性群集运动特性，通过分析FliL基因缺失株与野生株在固体LB培养基和Mot半固体培养基上的迁移运动，探究FliL基因对扬子鳄源普通变形杆菌运动的影响；通过小鼠致病性实验，探究FliL基因对细菌毒力的影响。[结果]生长曲线显示，细菌接种后5 h内FliL基因缺失株与野生株生长速度基本无差别，5 h后其生长速度慢于野生株；细菌群集运动和细菌动力实验显示，FliL基因缺失株群集运动明显减弱，但仍可在Mot半固体琼脂培养基上正常进行迁移运动；小鼠致病性实验显示，野生株XX2的LD_(50)为2.3×10~(6) CFU·mL~(-1)，FliL基因缺失株XX2ΔFliL的LD_(50)为4.9×10~(8) CFU·mL~(-1)，FliL基因缺失株LD_(50)升高了约100倍。[结论]FliL基因缺失可显著降低扬子鳄源普通变形杆菌的群集运动和细菌毒力，将为进一步研究扬子鳄源普通变形杆菌介导的扬子鳄痛风等疾病奠定基础。
关键词：
扬子鳄:普通变形杆菌 FliL基因 毒力
[期刊] 淡水渔业
[作者]
马亮 董靖 张国栋 张露珊 刘绍春 艾晓辉
本研究对患病克氏原螯虾(Procambarus clarkia)进行病原菌分离、鉴定及联合药敏试验。从患病克氏原螯虾的肝胰腺中分离出一株优势菌(QJ201905007),经形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA基因测序和构建进化树对该菌株进行了鉴定，并测定该菌株对抗菌药物的药敏性及化学抗菌药物和天然化合物的协同抑菌作用。结果显示：该分离菌生理生化特征符合普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的特征，分子鉴定结果和进化树分析与普通变形杆菌的亲缘关系较近，由此可判定该病原菌为普通变形杆菌。回归试验发现，分离的菌株对克氏原螯虾具有致病力，半致死剂量为5.04×10~6CFU/mL。药敏结果显示，该菌株对亚胺培南、头孢噻肟、恩诺沙星和头孢吡肟敏感，对氟苯尼考、青霉素和丁胺卡那等耐药；联合抑菌试验发现，氟苯尼考与白藜芦醇联用可在体外协同抑制该菌株的生长。以上研究表明，普通变形杆菌是克氏原螯虾的病原菌，在保证小龙虾食用安全的前提下，可使用恩诺沙星治疗，或通过氟苯尼考与白藜芦醇联用提高氟苯尼考的敏感性。
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
杨丽鸳 朱梦奕 何璟
为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制，以链霉菌整合型质粒ｐＪＴＵ２５５４为载体，构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主，通过生物活性筛选获得９株具有抑菌活性的异源表达突变菌株，同时通过ｐＣＲ筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。ＴＬＣ及ＨｐＬＣ－ＭＳ分析发现６个携带有ａＵＲｅｏＴＨｉｎ生物合成基因簇的ＣｏＳＭｉｄ，通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素ａＵＲｅｏＴＨｉｎ，证实文库异源表达及筛选的有效性。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
郭亚璐 马晓飞 史佳楠 张柳 张剑硕 黄腾 武鹏程 康昊翔 耿广荟 陈浩 魏健 窦世娟 李莉云 尹长城 刘国振
【目的】制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征。【方法】以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas9 5′端810 bp片段后克隆到p ET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株。用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas
[期刊] 淡水渔业
[作者]
张红英 李义 郭明凯 郝向举 孙汉 王玥
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtzlis)基因组DNA按5、20和80μg/kg剂量体腔注射中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(约0.1 mL/只),设注射等体积TE缓冲液为对照组,分别在第1、3、5、7天采样,测定该细菌DNA对中华绒螯蟹的免疫刺激作用。结果显示:注射上述3种剂量的枯草芽孢杆菌基因组DNA均能不同程度地提高中华绒螯蟹的THC、血细胞呼吸爆发活性和血清PO、ACP活性,试验组蟹的上述免疫指标的活性显著高于对照组(P0.05)。
[期刊] 西南农业学报
[作者]
李忆 蔡辉儒 蒲志刚 张敏 阎文昭
通过DNA提取方法对比,采用CTAB/LiCl法提取甘薯黑斑病菌基因组DNA,再利用限制性内切酶BamH I对纯化的甘薯黑斑病菌基因组DNA进行部分酶切,获得大小为15kb左右的DNA片段。将经BamHI酶切消化的Lambda DASH II载体臂与DNA片段相连,然后以大肠杆菌XL1BlueMRA(P2)为寄主细胞,在国内首次成功构建了甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata)基因组文库,所构建基因文库效价为4.12×105pfu/mL。
关键词：
甘薯黑斑病菌 噬菌体 基因组文库
[期刊] 水产学报
[作者]
李明辉 吴风瑞 熊传奇 曾圣 杨世杰 叶凯 蒋汶洮 孙运侣 黄宝锋 魏莹莹 焦静 顾源 王德寿
以pCC2FOS为载体构建尼罗罗非鱼Fosmid基因组文库,共挑选115 200个单菌落,保存在300块384孔样品板中,构建4 800个行池、7 200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度约为40 kb,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验研究表明,文库具有良好的稳定性。由于构建超级池-板池-行、列池三级池系统形成的微阵列,有助于快速、准确、有效地筛选目的基因,仅需77个PCR反应(超级池25+板池12+行池16+列池24)就能筛选到含有目的基因的一个单克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过文库尝试筛选18个与性别分化和生长相关基因,...
关键词：
尼罗罗非鱼 基因组文库 微阵列 基因筛选
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
段嘉 程功 胡永飞 李晶 律娜 朱宝利
利用宏基因组学方法,以人肠道微生物样品为原材料,构建了1个约30 000个克隆的fosmid文库。以三丁酸甘油酯为底物,通过功能筛选,获得1个酯解酶阳性克隆。对该阳性克隆构建亚克隆,挑选具有酯解酶活性的阳性亚克隆进行测序分析,最终获得1个肠道微生物来源的酯解酶基因(GenBank登录号:JQ972699)。结果表明,文库克隆的平均插入片段约为40kb,没有重复插入片段克隆。获得的酯解酶基因推演蛋白与Pyramidobacterpiscolens W5455的patatin样磷脂酶同源性最高,氨基酸一致性为95%。生物信息学分析结果表明该基因可能通过Vd型分泌方式进行分泌并发挥功能。本研究是通过...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
吕作舟 马爱民 杨新美
本文采用原生质体裂解法制备高分子量平菇总DNA。通过Sau 3A部分酶切和蔗糖密度梯度离心,获得15—26kb平菇总DNA酶切片段。并以Lambda的衍生物EMBL3为载体,酶连形成重组DNA。然后将其包装,转染受体菌LE392,在TB平板上获得2.5×10~4个重组子克隆。此重组子克隆群即构成中蔬10号平菇基因组文库。
[期刊] 水产学报
[作者]
张庆华 熊清明 肖琳琳 杨灏 杨先乐
从浙江象山网箱养殖的患体表溃烂症的大黄鱼(Pseudosciaena crocea)身上分离到7株细菌,人工感染试验表明分离菌株ZXS01、ZXS02、ZXS07为致病菌。常规生理生化测试表明,ZXS02菌株具有变形杆菌属(Proteus)的特征。为了进一步明确菌株ZXS02的分类学地位,测定其16S rRNA基因序列的1495个碱基,分析相关细菌相应序列的同源性,构建系统发生树,结果表明菌株ZXS02与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的同源性可达99.0%。用Sensitire细菌鉴定系统对其进行验证,测试结果表明与奇异变形杆菌的相似性达99.96%。综合上述结果,可鉴定菌...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
毛瑞鑫 鲁翠云 刘福军 赵莹莹 谷晶晶 常玉梅 梁利群 孙效文
利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库。并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12探针进行第二次筛选。结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5(;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8(。经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列。在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元。根据侧翼序列设计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增...
关键词：
中华绒螯蟹 微卫星 磁珠富集
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
张勇 傅刚 翟峰 朱宇旌 孙景霞 邵彩梅
为了研究3个不同蛋白质水平(10%、18%、26%)饲粮对肥育猪的钙蛋白抑制蛋白酶(CAST)的影响,对CAST蛋白提取、电泳、转膜等条件进行优化。试验表明:CAST被激活的条件是将蛋白提取液于上样缓冲液95℃煮15min后,立即在冰块上冷却,防止蛋白降解;采用分离胶浓度为10%进行电泳,可以明显检测到68kD、107 kD的CAST;采用预染Marker和DAB染色液可针对性地检测到目的蛋白的位置;利用上述程序检测到了猪CAST两种类型的表达,取得了较满意的结果。
关键词：
CAST 免疫印迹 肥育猪
[期刊] 浙江农林大学学报
[作者]
管雨 杨洋 张智俊 罗淑萍 汤定钦
从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有104个克隆的双元细菌人工染色体(BIBAC)基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
耿波 关云涛 孙效文
为了开展鲤基因组研究,深入研究遗传连锁图谱遗传标记的定位及数量性状的定位和克隆,并最终为分子育种提供服务,本实验构建了鲤的BAC基因组文库。通过采集黑龙江野鲤(Cyprinus caxpio haematopterus)全血细胞制备琼脂糖凝胶包埋块的方法获得了高分子量(HMW)DNA。通过BamHⅠ部分酶切和PFGE电泳分离选择获得100～300kb的DNA片段,用电洗脱和透析的方法对产物进行浓缩和纯化。纯化的HMWDNA连接到大小为7.2kb的克隆载体pEZBAC上。为了评估构建的文库的质量使用一系列引物对文库进行了验证。本研究首次构建黑龙江野鲤的BAC文库,该库含有46656个克隆,插入片...
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