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[期刊] 中国农业科学
[作者]
桑延霞 邓小娟 杨婉莹 刘文权 王文献 黄亚东 曹阳
【目的】黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)抗真菌肽Drosomycin(Drs)及其同系物Drosomycin-like C(Drs-lC)和斑腹刺螠蝽(Podisus maculiverntris)抗真菌肽Thanatin对丝状真菌具有广谱高效的抑杀作用。实现抗真菌肽基因在酵母中的高效分泌型表达,对探讨利用转基因酵母的发酵液直接进行果蔬、食品和农产品防腐保鲜的生物技术研发有重要意义。【方法】将Drosomycin基因(Drs)及其同系物基因Drs-lC和Thanatin基因分别与酵母分泌型表达载体pPICZαA重组,构建成重组表达质粒pPICZαA-Drs、pPICZ...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 崔保安 陈红英 王亚宾 张红英 魏战勇
【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中...
[期刊] 中国农业大学学报
[作者]
李兰 郑其升 张元鹏 李鹏成 肖希龙 付言峰 侯继波
为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PR
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
刘变芳 郭蔼光 金伟波 范三红
【目的】克隆果蝇抗菌肽Andropin基因,以期利用原核表达系统生产高活性抗菌肽。【方法】首先化学合成了目的基因的2个片段和1对引物,然后利用重叠区互补PCR法得到抗菌肽Andropin的全基因序列。构建了融合表达载体pET32a-Anp,并转入感受态细胞OrigammiB进行原核融合表达。重组菌株诱导表达后,用His-Tag Purification kit亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的蛋白用肠激酶切割并进行活性分析。【结果】在诱导温度37℃、1mmol/LIPTG诱导培养4h的条件下,可获得高效表达的融合蛋白;融合蛋白的表达量占总蛋白的30%,分子质量约为28ku,可溶性达70%以上;抗菌...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
杨婉莹 温硕洋 邓小娟 叶明强 夏庆友 曹阳 黄亚东
【目的】Drosomycin(Drs)是从黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中鉴定发现的对丝状真菌有广谱抗性的抗真菌肽因子,此外,在黑腹果蝇基因组中,还存在另外6条Drs同系物的基因序列,对它们推导的氨基酸序列具有与Drs相同的保守位点和CSαβ模体结构。为鉴定Drs及其6个同系物的抗性功能差异,研究其分子结构与功能的关系,需要对这些同系物基因进行克隆表达,获得有生物学活性的纯化样品。【方法】本文采用PCR分段互补合成的方法准确地获得了Drs同系物基因,并克隆至pET-3C载体上,转化到宿主菌E.coli Origami(DE3)中进行诱导表达,表达产物经阳离子CM S...
[期刊] 西南农业学报
[作者]
谭悠久 钟娟 周金燕 谭红
对实验室分离保存的40株毛壳菌菌株代谢产物进行抗真菌活性筛选,5个菌株代谢产物对植物病原真菌具有选择性抑制效果。其中,菌株CH08、CH23发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽菌、小麦根腐菌有较强的抑制作用;菌株CH16、CH17发酵液对芒果炭疽菌、苹果炭疽病具有较强的抑制作用;菌株CH21发酵液对西瓜枯萎菌、辣椒炭疽菌有较强的抑制作用。经形态学鉴定,CH08、CH16、CH17、CH23为球毛壳菌,CH21为角毛壳菌。
关键词：
抗真菌活性筛选 球毛壳菌 角毛壳菌
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
冯平 李云章 孙丰廷 屈雷 闫海龙
【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李荣荣 和祯泉 鲍恩东 陈溥言
【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 胡波 任雪枫 范志宇 张则斌 徐为中 何孔旺
用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定...
关键词：
家兔 γ-干扰素 克隆 重组杆状病毒
[期刊] 西南农业学报
[作者]
杨伟克 唐芬芬 刘增虎 董占鹏
【目的】探究家蚕眠期抗菌肽基因的表达变化规律,为深入拓展理解眠期家蚕免疫防御机制提供新线索。【方法】以四龄眠0、12、24 h和五龄起蚕的家蚕幼虫为实验材料,利用抑菌曲线法测定血淋巴的抑菌活性,采用实时荧光定量PCR检测脂肪体抗菌肽基因的表达情况。【结果】四龄眠0、12、24 h和五龄起蚕的血淋巴对金黄色葡萄球菌均无抑菌作用,而四龄眠12和24 h的血淋巴对大肠杆菌均有明显的抑菌作用。这表明眠期家蚕血淋巴出现了选择性抑菌活性。在四龄眠至五龄起蚕不同发育时间,抗菌肽基因Lebocin3和Moricin的表达量无显著变化;Attacin1基因仅在四龄眠24 h出现上调表达;CecropinB6和Gloverinv2基因的表达量逐渐减弱,呈现下调表达的趋势,而Enbocin2和DefensinB的表达量逐渐升高,呈现上调表达趋势。【结论】眠期家蚕抗菌肽基因表达规律并不一致,Attacin1、Enbocin2和DefensinB可能在家蚕眠期发挥一定的免疫防御功能。
关键词：
家蚕 眠期 抗菌肽基因 转录表达
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
秦磊 王恒安 欧阳志明 顾翠妹 成志恒 赵国屏
在土壤中分离到一株细菌STRA ,菌块测定法显示该菌可显著抑制玉米小斑病菌和稻恶苗病菌 ,具有抗真菌活性。该菌可以在SFM和LB等多种培养基上生长 ,且菌落生长无明显终止现象 ;革兰氏染色为阴性 ,电镜观察可见 2～ 4根鞭毛。 (G +C) %在 5 9%～ 6 7%范围内。生化指标的检测显示该菌株对所测试的多数糖类不能发酵 ,经BioMerieuxVitek的革兰氏阴性细菌检测试验卡 (GNI)鉴定为食酸丛毛单胞菌 (Delftiaacidovorans)。设计两对简并引物对其 16SRNA进行PCR扩增 ,16SRNA的序列及其相关生物信息学分析结果进一步确证生化鉴定结果。该分离株的抗真...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱善元 王安平 吴双 王永娟 左伟勇 洪伟鸣
根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了...
关键词：
禽腺联病毒 Rep基因 昆虫细胞 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
岳润清 铁双贵 齐建双 韩小花 燕树锋
对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行改造,以获得密码子优化的抗虫基因,构建原核表达载体后,将重组载体转入大肠杆菌进行诱导表达并对诱导蛋白进行抗虫试验。首先根据植物密码子的偏好性及使用频率,优化、改造并人工合成了Cry1Ab基因,序列分析表明:改造后的Cry1Ab基因全长1 848 bp,与原始序列同源性为66%,G+C含量由原来的37.34%提高到63.04%。将改造后的Cry1Ab基因与原核表达载体p ET28b(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性菌液进行诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示:Cry1Ab蛋白在BL21(DE3)细胞中得到高效表达,分子量为7...
[期刊] 西北农林科技大学学报(自然科学版)
[作者]
徐凌飞 王贵章 梁东 张军科 马锋旺
利用抗真菌病害基因转化苹果主栽品种"嘎拉",以期提高其对真菌病害的抗性。通过对影响农杆菌介导苹果遗传转化因素的研究,建立了农杆菌介导的嘎拉叶片遗传转化体系。利用叶盘法转化受体材料,将-β1,3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因导入苹果中。对获得的"嘎拉"转化植株进行PCR检测,结果初步表明,外源基因已经整合到"嘎拉"苹果基因组中。
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