[目的]从昆仑雪菊中分离纯化抑制血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性成分,鉴定其化学结构,并评价其对ACE的抑制活性。[方法]以抑制ACE活性为指标,筛选出最佳的昆仑雪菊萃取溶剂,提取得到粗提物,活性跟踪分离纯化粗提物中的单体化合物,并对单体化合物的活性进行评价。[结果]最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到5个单体化合物,采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为咖啡酸甲酯;化合物2为脱镁叶绿素a;化合物3为β-香树脂;化合物4为异奥卡宁-7-O-β-...

采用截留分子量分别为30 ku、10 ku、6 ku、3 ku的中空纤维超滤膜对扇贝酶解产物进行分级分离,并结合凝胶柱层析分离技术测定了各分离组分的分子量分布,同时还测定了各分离组分对血管紧张素转换酶(ACE)的抑制活性。实验结果表明,不同截留分子量超滤膜可以实现酶解产物按其分子量大小的分级分离,不同分离组分的ACE抑制力活性差异较大,总趋势是截留分子量相对较小的超滤膜透过液的ACE抑制活性较强。其中,截留分子量为3 ku超滤膜的透过液具有最强的ACE抑制活性,其ACE抑制率I(%)=96.17%,半抑制浓度IC_(50)= 0.078 mg·mL~(-1)。通过对截留分子量为3 ku超滤膜的...

从昆仑雪菊中分离纯化具有抗氧化活性的单体化合物。以抗氧化活性为指标,采用活性追踪的方法,筛选最佳的昆仑雪菊黄酮类化合物提取溶剂并对粗提物进行分离纯化得到单体化合物,并采用铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP法)、1,1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法(DPPH法)和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐自由基清除法(ABTS法)对化合物进行活性评价。结果表明:最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到2个单体化合物;采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为2',3,4,4'-四羟基查尔酮...

以抗氧化活性为指标,采用活性追踪的方法,筛选最佳的昆仑雪菊黄酮类化合物提取溶剂并对粗提物进行分离纯化得到单体化合物,并采用铁离子还原/抗氧化力测定法(FRAP法)、1,1-二苯基-2-硝基苯肼自由基清除法(DPPH法)和2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐自由基清除法(ABTS法)对化合物进行活性评价。结果表明:最佳的提取溶剂为甲醇,利用常压硅胶柱层析和Sephedex LH-20柱层析从粗提物中分离得到2个单体化合物,采用核磁共振(NMR)和电喷雾质谱(ESIMS)鉴定其化学结构:化合物1为2′,3,4,4′-四羟基查尔酮,化合物2为4,2′,4′-三羟基查尔酮。抗氧化...

采用3942中性蛋白酶酶解中国毛虾(Aceteschinensis)蛋白,制备具有抑制血管紧张素转移酶(ACE)活性的多肽。采取正交实验研究料水比、酶量、反应温度、反应时间4个因素对酶解中国毛虾蛋白产物的ACE抑制活性的影响。结果显示,在料水比1∶3(体积比),酶量0.5%,温度45℃,时间8h的水解条件下得到的酶解产物F7的ACE抑制活性最高,其抑制率达到92.86%。用层析柱SephadexG25、SPSephadexC50对F7进行分离纯化,选取ACE抑制活性最高的峰进一步用反相高压液相色谱进行纯化,得到单一组分FⅠ。经飞行时间质谱和碰撞诱导裂解分析确定,FⅠ为新型的ACE抑制肽SerP...

[目的]本试验在已有研究血管紧张素系统(RAS)在乳腺中保护作用的基础上,对该家族的主要成员血管紧张素转换酶2(ACE2)在对抗高精料所致奶牛乳腺氧化应激、炎性损伤及细胞凋亡中的作用及机制进行了探讨。[方法]6头健康的泌乳期荷斯坦奶牛,随机分为对照组[m(精)∶m(粗)=4∶6]和高精料组[m(精)∶m(粗)=6∶4],采用单栏、定时、定量饲喂。饲喂20周后,活体取乳腺组织,进行如下试验:1)测定乳腺组织中氧化应激指标·OH水平及TNOS、SOD活性;2)ELISA法测定炎性指标TNFα、IL-1β和凋亡指标Caspase-3、Bax、Bcl-2;3)Western blot分析乳腺组织中ACE2和ACE蛋白的表达;ELISA法测定AngⅡ和Ang1-7的含量。[结果]高精料长期饲喂,奶牛乳腺组织中·OH自由基水平显著升高(P<0.05),SOD活性降低,TNOS活性降低显著(P<0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平均显著升高(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平显著升高(P<0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(P<0.05);乳腺组织中AngⅡ浓度(P<0.05)和ACE蛋白表达水平极显著升高(P0.05),但Ang1-7浓度显著降低(P<0.05)。[结论]长期饲喂高精料可导致奶牛乳腺自由基激活、炎症因子释放、细胞凋亡,乳腺局部损伤。乳腺局部组织中RAS处于激活状态,2条轴互相拮抗,表现为AngⅡ水平升高,ACE2水平降低。

[目的]本文旨在探索猪血管紧张素转化酶2(ACE2)在大肠杆菌中最佳表达条件和纯化蛋白的最佳方法。[方法]将已构建好的猪重组表达载体p ET-32a-ACE2转染至大肠杆菌BL21(DE3),通过改变IPTG诱导浓度以及诱导时间来对诱导表达条件进行筛选,实现目的蛋白高效表达后选用Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法,对获得的重组猪p ET-32aACE2融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE和免疫印迹等分析鉴定表达产物。[结果]当IPTG浓度为1 mmol·m L-1、诱导时间为10 h时,ACE2蛋白在BL21(DE3)中表达量最高,以包涵体形式存在。表达产物的相对分子质量约为100×103,与预期目的蛋白大小相符。选用的Ni~(2+)-NTA亲和层析和KCl染色切胶2种方法纯化重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体,均能得到可溶性的重组蛋白,但KCl染色切胶法纯化获得的可溶性重组蛋白浓度及纯度都更佳,纯化蛋白经Western blot鉴定具有良好的抗原性。[结论]本试验建立猪p ET-32a-ACE2重组蛋白诱导表达的最佳条件:IPTG浓度1 mmol·m L-1,诱导时间为10 h。并且以KCl染色切胶法纯化该重组p ET-32a-ACE2融合蛋白包涵体效果更好。

家猫能自然及人工感染SARS病毒,本研究旨在探讨家猫ACE2潜在的SARS病毒受体功能。以人血管紧张素转换酶2(ACE2)序列为模板,用同源模建法模拟了家猫ACE2的三维空间结构,发现家猫ACE2与人ACE2结构十分相似,其结合严重急性呼吸综合症(SARS)病毒囊膜纤突(S)蛋白的关键氨基酸的同源性很高(15/18)。将家猫血管紧张素转换酶2基因N端1-367 aa对应的基因片段及其跨膜区克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+)B中,构建了表达质粒pcDNA-mA367,转染HeLa细胞,间接免疫荧光检测表明fACE2的N端片段已在细胞膜上成功表达。

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸...

[目的]通过建立油酸诱导的大鼠肝脏间质细胞（BRL-3A）细胞非酒精性脂肪肝细胞（NAFLD）损伤模型，探讨BRL-3A细胞中RAS的ACE/AngⅡ/AT1R和ACE2/Ang-1-7/Mas这两条通路相互负向调节与NAFLD细胞损伤的关系。[方法]采用不同浓度油酸（0.025、0.05、0.1和0.2 mmol·L~(-1)）处理BRL-3A细胞24 h，通过细胞活力、细胞内甘油三酯（TG）含量、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性以及油红染色确立NAFLD细胞模型条件。然后选取低中高3个油酸浓度（0.025、0.1和0.2 mmol·L~(-1)）作用于细胞24 h进行后续试验。ELISA法检测细胞上清中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、血管紧张素1-7（Ang1-7）含量；Western blot分析细胞内血管紧张素转化酶（ACE）、血管紧张素转化酶2（ACE2）、血管紧张素Ⅱ受体1（AT1R）、Mas受体（MasR）蛋白水平。斯皮尔曼相关性分析方法分析不同浓度油酸刺激24 h与细胞内ACE、ACE2等的相关性。[结果] 1) 用0.1 mmol·L~(-1)油酸处理BRL-3A细胞24 h，成功建立BRL-3A细胞NAFLD模型。2) 油酸处理BRL-3A细胞细胞24 h后, BRL-3A细胞出现脂滴沉积，在0.025 mmol·L~(-1)油酸（低浓度）组，ACE2、Ang1-7、MasR水平有升高趋势，AngⅡ 含量与AT1R表达下降，ACE/ACE2比值下降；0.1 mmol·L~(-1)油酸（中浓度）组ACE、AT1R表达显著升高，其他RAS成员变化不明显；0.2 mmol·L~(-1)油酸（高浓度）组，ACE2、Ang1-7、MasR表达水平或含量下降，ACE、AngⅡ、AT1R、ACE/ACE2比值升高。3）斯皮尔曼相关分析显示, 油酸浓度、血液相关生化指标（TG含量、AST和ALT活性）和脂滴数及脂滴面积与ACE2表达水平和Ang1-7含量呈负相关，而与ACE表达水平、AngⅡ含量呈正相关。[结论] BRL-3A细胞中的两条轴共同参与了油酸致BRL-3A细胞NAFLD损伤的发生发展过程。低浓度油酸时，ACE2介导的Ang1-7/MasR通路占优势；高浓度油酸处理细胞损伤加重，ACE介导的AngⅡ /AT1R通路占主导地位。ACE2与油酸致细胞炎性损伤的程度呈显著负相关。

[目的]本文旨在筛选对黄曲霉和禾谷镰刀菌具有抑制活性的乳酸菌,并确定乳酸菌发酵液(CFS)中主要的抑制霉菌物质。[方法]采用累积富集法从谷物中分离乳酸菌,用双层平板法测定其对黄曲霉和禾谷镰刀菌的抑制活性,同时用96孔板法测定乳酸菌发酵液对2种霉菌孢子的抑制活性,筛选具有最佳抑制活性的乳酸菌菌株并进行鉴定。采用pH值调节、蛋白酶处理和热处理的方法分析发酵液中有效抑制霉菌物质的种类,通过HPLC法测定发酵液中主要有机酸的含量,并采用傅里叶红外光谱和SDS-PAGE凝胶电泳测定戊糖片球菌Y5发酵液中蛋白类抑制霉菌物质。[结果]从谷物中初筛出139株乳酸菌,其中12株对黄曲霉有高度抑制作用,14株对禾谷镰刀菌有高度抑制作用。Y5、Y9、S2和S9 4株乳酸菌的发酵液对黄曲霉孢子萌发的抑制效果较好;Sm1、Sm12、S6和N6 4株乳酸菌的发酵液对禾谷镰刀菌孢子萌发的抑制效果较好。经过鉴定,8株乳酸菌分别为乳酸片球菌(N6、S2和Y9)和戊糖片球菌(Y5、Sm12、Sm1、S6和S9)。不同pH值调节和蛋白酶处理对发酵液的抑制霉菌活性有不同的影响,但热处理不改变抑制霉菌活性。发酵液中含量最高的有机酸为乳酸、乙酸和柠檬酸,戊糖片球菌Y5发酵液中存在蛋白类抑制霉菌物质。戊糖片球菌Y5粗提物的傅里叶红外光谱中存在蛋白质和多糖特征峰,胰蛋白酶处理后其SDS-PAGE凝胶电泳条带改变,戊糖片球菌Y5发酵液中存在的蛋白类抑制霉菌物质为糖蛋白。[结论]本文共筛选出8株对黄曲霉或禾谷镰刀菌有明显抑制作用的乳酸菌,发酵液的抑制霉菌活性是有机酸共同作用的结果,戊糖片球菌Y5发酵液中存在具有抑制霉菌活性的糖蛋白。

为探讨血管紧张素II(angiotensin II,AngII)对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,采用鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,并用油红O染色法和还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinuceotid,NADH)氧化速率法检测了3T3-L1脂肪细胞分化过程中胞浆脂质的累积和甘油磷酸脱氢酶(glycerol phosphatedehydrogenase,GPDH)的活性。结果表明,100 nmol/L的AngII可显著增大3T3-L1前脂肪细胞分化过程中胞浆脂质累积和GPDH活性(P<0.01),外源性AngII可促进3T3-L1前脂肪细胞的分化...

【目的】研究凤丹种子胚乳中内源抑制物质活性及其成分组成，为了解其休眠机理提供参考。【方法】采用系统溶剂分离法，分离萃取凤丹胚乳中的内源抑制物质，对４种有机溶剂（石油醚、乙酸乙酯、乙醚、甲醇）萃取液和水相进行白菜种子发芽试验，确定发挥抑制作用的优势组分，并对其成分进行ＧＣ－ＭＳ分析。【结果】凤丹种子胚乳各有机溶剂萃取液对白菜种子发芽率和幼苗苗高生长、根长生长均有不同程度的抑制作用，但抑制物质活性存在一定差异。４种有机溶剂萃取液中抑制作用最强的是乙醚组分，其次是甲醇组分，再次是乙酸乙酯组分。利用ＧＣＭＳ方法从乙醚组分中共检出６种物质，主要为乙酸（６６．６６１％）、甲酸（２５．９９６％）、乙酐（２．．．．

【目的】蔗糖转化酶是植物中糖信号调控途径中的关键因子之一,它们在调控植物糖代谢、生长发育、抗病和抗逆等过程中起着至关重要的作用。蔗糖转化酶抑制子是一类同源性较低的蛋白质家族,通过调控蔗糖转化酶抑制子的表达量可以抑制蔗糖转化酶活性。本课题组前期分离到甘薯转化酶抑制子IbINH全长ORF,本文对20种转化酶抑制子进行了生物信息学比较分析,可为深入研究IbINH基因功能提供参考。【方法】本研究以前期克隆获得的IbINH全长ORF推测的氨基酸序列和NCBI数据库中搜集到的其余19种植物INH氨基酸序列为分析数据来源,采用系列生物信息学分析软件对INH蛋白质的氨基酸组成及其理化性质、蛋白质亲疏水性、磷酸化位点、INH蛋白质的二级元件和含量、跨膜结构域和信号肽、蛋白质亚细胞定位、功能结构域和空间三维结构等进行预测和分析。【结果】根据预测和分析发现,IbINH同其他INH蛋白质一样均含有典型的PMEI-like超级家族功能结构域,二级结构组成和比例也比较相似,INH蛋白质定位在细胞质的可能性最大,但是各种INH的亲疏水性、稳定性以及跨膜结构域等也有差异。【结论】本文通过对INH蛋白质进行系列生物信息学分析和比较,为以后IbINH基因功能研究奠定了重要基础。

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定...