选择合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件。选择了奶牛乳腺研究中广泛使用的7个候选内参基因,包括GAPDH、ACTB、18S rRNA、RPS9、RPS15、UXT、MYC。奶牛以精粗比不同的2种日粮饲喂,并在产后16 d采集乳腺组织。利用qRT-PCR技术探讨了候选内参基因在围产奶牛乳腺组织中的表达情况,并利用geNorm程序对数据进行分析。结果发现,UXT和RPS9表达稳定,不受日粮精粗比的影响,因此,可作为围产期奶牛乳腺组织基因表达分析中相对合适的内参基因。

采用蛋白质组学方法,检测了产前注射维生素AD3E(V-AD3E)对围产期奶牛乳蛋白表达的影响.二维凝胶电泳分离了产后第1天和第21天乳蛋白组分,凝胶经染色、酶切、图像采集和斑点比对,与对照(不注射V-AD3E)组第1天乳蛋白图谱相比,注射组第1天乳蛋白图谱上有5个区域的蛋白表达上调,经高效液相色谱串联离子阱质谱对差异表达蛋白进行鉴定,主要为免疫球蛋白G(IgG)和白蛋白.产前注射V-AD3E上调了初乳中的IgG和白蛋白,不仅为饲喂初乳的犊牛提供了更好的免疫保护,而且提高了处于免疫抑制阶段母牛的抗病力.

【目的】通过奶牛乳腺上皮细胞体外培养试验,研究黄花蒿乙醇提取物对乳腺上皮细胞中与共轭亚油酸(CLA)合成相关酶的基因SCD表达的影响,探讨其对乳脂肪合成相关酶ACACA和FASN基因以及与脂肪转运相关酶LPL基因表达的影响,旨在从乳腺层次探明黄花蒿乙醇提取物对乳中CLA合成的部分作用机制。【方法】将采自于健康泌乳中期荷斯坦奶牛的乳腺组织用保温盒带回实验室,在无菌条件选取腺泡较多的深层组织,采用胶原酶消化法获得乳腺上皮细胞,放于37℃,CO2浓度为5%的培养箱中进行原代培养。试验所用的细胞是经过复苏的第二代细胞,待细胞复苏后,以3×104个/mL的密度接种细胞到24孔板中,分别置于37℃的5%CO2培养箱中培养,采用台盼蓝计数法每天进行一次计数,设3个重复,连续7 d,未计数组每2天换液一次,绘制细胞生长曲线。另外,待细胞生长至对数增殖期,更换新鲜培养液,随机分为4组,即培养液中黄花蒿提取物的浓度为0、3.0、6.0、12.0 mg·L-1,提取物作用时间均为48 h,检测不同浓度黄花蒿提取物对与脂肪酸合成相关酶SCD、ACC、FAS、LPL基因表达量的影响。每个处理3个重复。【结果】使用倒置显微镜观察,乳腺上皮细胞形态呈铺路石样;在3×104个/mL的接种密度下,细胞生长曲线呈S型,在1—2d乳腺上皮细胞为潜伏期,3—6d为指数增长期,之后进入平台期,符合一般细胞生长曲线规律,说明培养的乳腺上皮细胞具有正常的增殖能力,可以用于后续的研究;与对照组相比,添加黄花蒿乙醇提取物有增加SCD酶基因表达量的趋势,其中3mg·L-1组显著增加了SCD酶的基因表达量(P0.05);添加黄花蒿乙醇提取物有增加乳腺上皮细胞中ACACA基因表达量的趋势,但与对照组相比差异不显著(P>0.05),且随着添加剂量的增加,有下降趋势;添加黄花蒿乙醇提取物可以增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量,呈剂量依赖型增加,且12mg·L-1组可以显著增加乳腺上皮细胞中FASN基因表达量(P<0.05)。【结论】黄花蒿乙醇提取物可以增加奶牛乳腺上皮细胞中SCD、ACACA和FASN酶基因的表达,有利于调控CLA和乳脂肪的生成。

为分析苜蓿素对脂多糖诱导下体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗炎和乳蛋白合成相关基因表达的影响,本研究将体外培养的奶牛乳腺上皮细胞分成4组,即基础培养基(对照)和基础培养基中分别加入1μg·m L-1LPS(L)、1μg·m L-1LPS+10μg·m L-1苜蓿素(L+T)和10μg·m L-1苜蓿素(T)。结果显示,1)与对照组相比,L组奶牛乳腺上皮细胞的活性显著下降(P<0.05),而T组则显著升高(P<0.01)。2)L+T组细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于L组(P<0.01),而一氧化氮(NO)

旨在探索不同浓度玉米赤霉烯酮(ZEN)对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)生长和乳脂合成相关基因表达的影响。首先，用不同剂量ZEN处理MAC-T细胞36 h,血细胞计数板统计细胞数量，染色并分析细胞凋亡与坏死情况，筛选ZEN添加的合适剂量；接着，试剂盒检测ZEN对MAC-T细胞中活性氧(ROS)以及线粒体膜电位的影响；最后，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术，分析ZEN对MAC-T细胞增殖、凋亡、氧化应激和乳脂合成相关基因表达的影响。结果表明，低剂量ZEN(0.01～1.00μmol/L)有促进MAC-T生长的趋势，而高剂量ZEN(5.00～10.00μmol/L)显著降低MAC-T细胞数量；0.10μmol/L ZEN对MAC-T中ROS和线粒体数量无明显影响，但10.00μmol/L ZEN显著增加了MAC-T中ROS水平，降低了线粒体数量；RT-qPCR结果表明，0.10μmol/L ZEN显著促进增殖基因(CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但同时提高了凋亡基因(CAS-3、BAX)表达量；10.00μmol/L ZEN显著抑制增殖基因(PCNA、CDK1、CCND2)、抗氧化基因(DHODH、GPX4、AIFM2)和抗凋亡基因(BCL-2)表达，但显著促进凋亡基因(CAS-3、BAX)表达；值得注意的是，0.10μmol/L ZEN显著促进了乳脂合成相关基因(PPARγ、FASN、JAK-2),但10.00μmol/L ZEN显著抑制了这些基因表达。上述结果提示，不同浓度ZEN对MAC-T细胞的作用存在差异：0.10μmol/L ZEN可以促进MAC-T细胞生长和乳脂合成相关基因表达的同时，也会诱导凋亡基因表达；10.00μmol/L ZEN会诱导MAC-T细胞氧化应激、降低线粒体数量，抑制增殖、抗氧化、抗凋亡和乳脂合成相关基因表达，同时促进凋亡基因表达，导致细胞死亡。

[目的]本试验旨在探讨去乙酰化蛋白7(sirtuin 7,SIRT7)对奶牛乳腺上皮细胞(DCMEC)合成乳蛋白、乳脂和乳糖关键基因表达的影响。[方法]以体外原代培养的中国荷斯坦奶牛DCMEC为试验材料,纯化后转染质粒p CDNA3.1-SIRT7,继续培养48或72 h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western blot法检测乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因mRNA和蛋白的表达;通过特异性试剂盒检测胞内和培养基中甘油三脂(TG)含量。[结果]1)乳蛋白:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高αs1-酪蛋白基因(CSN1S1)、β-酪蛋白基因(CSN2)和ETS转录因子基因(ELF5) mRNA水平,促进CSN2蛋白合成,激活雷帕霉素靶蛋白(m TOR)磷酸化; 2)乳脂:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳脂合成关键因子过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1) mRNA和蛋白水平,显著增加细胞内甘油三酯(TG)含量; 3)乳糖:与对照组相比,过表达SIRT7可显著提高乳糖合成关键因子葡萄糖转运蛋白1(GLUT1) mRNA表达。[结论]在体外培养条件下,过表达SIRT7可促进DCMEC中乳蛋白、乳脂和乳糖合成关键基因的表达。

选择4头安装有永久性瘤胃瘘管的泌乳奶牛,按4×4拉丁方设计,分别饲喂精粗比约为30∶70的“高低质粗料型”日粮、30∶70的混合型高青贮日粮、50∶50的精粗料比例相当的日粮及65∶35的高精料日粮等4种不同精粗比日粮,研究日粮精粗比对奶牛瘤胃发酵及泌乳性能的影响。结果显示,日粮精粗比对奶牛瘤胃pH值,氨氮质量浓度,总挥发性脂肪酸、丙酸、丁酸的浓度和乙酸/丙酸、(乙酸+丁酸)/丙酸有显著(P<0.05)或极显著(P0.05);饲喂不同精粗比日粮,奶牛乳产量、4%标准乳产量均有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异,而乳脂、乳蛋白、乳糖...

［目的］本文旨在探究ｐ３８通路及相关因子与乳房炎的关系。［方法］选择正常和患临床乳房炎２组共６头荷斯坦奶牛进行研究。收集２组奶牛的乳样、血样以及组织样品，利用石蜡包埋和ＨＥ切片染色对奶牛乳腺组织进行观察，通过实时荧光定量ｐＣＲ（ＲＴ－ｑ ｐＣＲ）对ｐ３８、ＴＬＲ４、ＴＮＦ－α和ＩＬ－１βｍＲＮＡ水平的表达进行分析，通过ＥＬＩＳＡ和ＷＥＳＴＥＲＮ ｂＬｏＴ对ｐ３８、ＴＬＲ４、ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β蛋白水平的差异表达进行分析。［结果］患乳房炎奶牛乳腺组织中ｐ３８、ＩＬ－１β和ＴＮＦ－αｍＲＮＡ水平表达显著升高（ｐ＜０．０５）。ＥＬＩＳＡ结果表明：两组样品中炎症因子ＴＮＦ－α和ＩＬ－１β的表达水平差．．．

为了构建HSP72慢病毒表达载体,建立稳定表达HSP72的牛乳腺上皮细胞系。以牛HSP72基因序列为模板,设计并合成引物,PCR扩增目的基因,连接到慢病毒表达质粒中,用包装获得的慢病毒感染牛乳腺上皮细胞,经一定浓度的嘌呤霉素筛选,Hochest33342法对细胞核定位,倒置荧光显微镜下观察转染效率,用免疫组化和Western Blot方法验证感染细胞是否稳定表达HSP72。结果显示,携带HSP72基因的慢病毒滴度约为1. 0×109TU/m L;确定嘌呤霉素的最佳筛选浓度为2μg/m L;牛HSP72慢病毒感染细胞表达HSP72,感染的奶牛乳腺上皮细胞在倒置荧光显微镜下可看到绿色荧光,转染效率可达90%以上;免疫组化结果表明,正常细胞和空载体感染细胞,HSP72呈现低表达,转染携带HSP72目的基因载体细胞,HSP72高表达,呈现颜色较深的棕色; Western Blot方法检测证实与正常转染细胞相比,慢病毒空载体转染的奶牛乳腺上皮细胞HSP72表达稍有降低,但无统计学差异,而携带HSP72基因的慢病毒载体转染的细胞HSP72呈现高表达,且差异极显著(P

【目的】采用real-time PCR方法检测体外激素处理对奶牛乳腺上皮细胞FcRn(neonatal Fc receptor,FcRn)mRNA表达的影响。【方法】在乳腺上皮细胞培养液中添加不同浓度胰高血糖素(0.01、0.1和1μmol.L-1)、胰岛素(0.005、0.1和0.5μmol.L-1)、甲状腺素T4(0.01、0.1和1μmol.L-1),体外培养并收集细胞,提取细胞mRNA后,利用real-time PCR检测FcRn mRNA的相对丰度。【结果】在一定添加剂量范围内,随着添加剂量的增加,甲状腺素和胰高血糖素能够显著地促进FcRn mRNA表达量升高(P<0.05),胰岛素...

为研究不同精粗比全价颗粒饲料对犊牛不同组织中SREBP-1、FASN、SCD1和ApoA1mRNA表达的影响,选取日龄和体重相近的中国荷斯坦断奶公犊牛12头,分为4组,每组3头,各试验组精粗比分别为75∶25(Ⅰ)、70∶30(Ⅱ)、65∶35(Ⅲ)和60∶40(Ⅳ),预试期14d,正试期56d。结果表明,试验Ⅱ组肝脏、十二指肠和瘤胃中的SREBP-1和ApoA1mRNA相对表达量显著高于试验Ⅳ组(P<0.05),而在瘤胃和肌肉中的结果与之相反;试验Ⅰ组犊牛肝脏和十二指肠以及试验Ⅲ组瘤胃中的SCD1mRNA...

【目的】奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最为常见,同时也是带来经济损失最为严重的疾病之一,其主要病因是细菌感染。奶牛乳腺的固有免疫是抵抗病原菌入侵的第一道防线。NOD2是机体固有免疫模式识别受体核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)蛋白家族中的重要一员,通过识别其特异性配体胞壁酰二肽(muramyl dipeptide,MDP)——一种广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中的成分,而参与抵抗多种病原菌入侵。奶牛乳腺上皮细胞(bovine

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以106细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L~(-1)浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L~(-1) Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L~(-1) Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L~(-1) Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L~(-1)的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L~(-1)的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L~(-1)硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L~(-1)硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L~(-1)和8μmol·L~(-1)硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P

应用乳酸脱氢酶(LDH)活力测定、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术,检测转化生长因子β1(TGF-β1)对奶牛乳腺组织细胞活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。用10 ng.mL-1TGF-β1处理乳腺组织48 h,分别在不同时间点收集组织和培养液检测各指标,以0 h不加TGF-β1作为对照组。结果显示,随TGF-β1作用时间的延长组织细胞活率逐渐降低,24 h和48 h组显著低于对照组(P

【目的】探讨TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。【方法】TGF-β1作用乳腺上皮细胞不同时间,收集细胞及培养液,应用MTT检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测LDH活性、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、Western bolt技术分析HSP70蛋白的表达量。【结果】1、5、10ng·ml-1的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10ng·ml-1TGF-β1组与对照组差异显著(P<0.05);10ng·ml-1TGF-β1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐升高,其中6、12和24...