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[期刊] 水产学报
[作者]
赵倩倩 孙西超 郑诚 薛程 孙盛明
为探究细胞凋亡相关基因Bax (B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用，实验采用cDNA末端快速扩增(RACE) PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡基因Bax基因cDNA全长序列，采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况，同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位。日本沼虾Bax基因cDNA全长2 287 bp (NCBI登录号：MZ823353)，包括5 '非编码区(UTR)为42 bp，3' UTR为814 bp，开放阅读框(ORF) 1 431 bp，编码476个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析，氨基酸相似度比对显示，日本沼虾细胞凋亡基因Bax富含高度保守的BH1、BH2及BH3结构域；系统进化树分析显示，日本沼虾Bax基因与斑节对虾等甲壳动物Bax聚类一支，具有最近的亲缘关系。RT-PCR结果表明，日本沼虾Bax基因在肝胰脏中表达最高，在脑中表达最低。在低氧胁迫1～96 h时，日本沼虾鳃和肝胰腺组织Bax基因表达量均显著高于对照组，这与日本沼虾Bax蛋白表达丰度基本相似。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白Bax，并将纯化重组蛋白免疫兔子获得抗血清。免疫组化结果显示，鳃和肝胰腺Bax蛋白阳性信号主要定位在鳃上皮细胞和肝细胞中。最后，采用流式细胞仪分析表明，日本沼虾血细胞凋亡率在低氧胁迫96 h时显著高于对照组，这与日本沼虾Bax基因转录水平和蛋白表达丰度相吻合。日本沼虾Bax基因在日本沼虾不同组织应答低氧胁迫分子过程中均具有促凋亡作用。为探明日本沼虾不耐低氧的分子机制提供理论参考。
[期刊] 水产学报
[作者]
郑诚 薛程 赵倩倩 孙盛明
为了研究类固醇激素合成急性调节蛋白 (StAR)在日本沼虾应答低氧胁迫过程中所发挥的作用，实验应用cDNA末端快速扩增 (RACE) PCR技术克隆了日本沼虾StAR全长cDNA序列，并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析，采用半定量RT-PCR方法分析StAR在日本沼虾不同组织的分布情况，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与Western blot技术对其在不同低氧胁迫阶段中的表达规律进行检测，观察低氧胁迫下精巢组织中StAR蛋白免疫组化定位。结果显示，日本沼虾StAR其cDNA全长3 361 bp (NCBI登录号：MW263908)，包括5′-UTR 323 bp，3′-UTR 2 129 bp，开放阅读框909 bp，编码302个氨基酸。氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示，日本沼虾StAR基因与三疣梭子蟹等甲壳动物StAR聚类一支，具有最近的亲缘关系。半定量RT-PCR检测结果显示，StAR在日本沼虾不同组织中均有表达，其表达量在肝胰腺和心脏组织中最低，在精巢组织中表达处于较高水平。使用qRT-PCR技术检测日本沼虾精巢中StAR在低氧胁迫下时空表达情况，结果表明，与对照组相比，低氧处理组精巢中StAR基因表达量在1～48 h均显著上调，而在低氧处理组96 h显著降低。此外，本实验对StAR进行了原核表达及抗血清制备，采用Western blot检测StAR蛋白表达丰度基本与基因表达模式相似，免疫组化结果显示，StAR 蛋白在精细胞与间质细胞中均有表达。综上所述，长期低氧胁迫显著降低了StAR基因的转录表达水平，并且该基因可能在类固醇合成路径及精子发生过程中均发挥重要作用。本研究结果为进一步解析日本沼虾类固醇激素合成分子机制奠定基础。
关键词：
日本沼虾 StAR 克隆 低氧 表达分析
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
韩一鸣 鲁苏皖 许志强 徐宇 林海 潘建林 杨家新 李旭光
虾青蛋白(Crustacyanin， CRCN)在甲壳动物脂类代谢及低氧胁迫应激调控等方面具有重要的功能。为获取虾青蛋白在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)性腺发育和低氧胁迫应答中的作用，本研究在克氏原螯虾肝胰腺组织中鉴定出1个类虾青蛋白PcCRCN-L基因的cDNA序列，分析了PcCRCN-L基因的结构特征和进化模式，研究了PcCRCN-L基因在不同组织与性腺不同发育时期的表达特征，探讨了PcCRCN-L在低氧–复氧胁迫下的表达响应模式。结果显示，PcCRCN-L基因cDNA序列长2 700 bp，其开放阅读框(ORF)长度为1 587 bp，编码528个氨基酸残基；DNA序列长6 130 bp，位于克氏原螯虾基因组的第12号染色体，包含5个外显子和4个内含子，内含子/外显子剪接方式符合GT-AG规则。PcCRCN-L具有1个完整的lipocalin结构域，包含典型的序列保守区Ⅰ(SCR1)序列G-X-W、保守区Ⅱ(SCR2)序列T-D-Y和保守区Ⅲ(SCR3)序列精氨酸R。多序列比对与系统进化分析结果显示，PcCRCN-L独立于传统虾青蛋白A和C亚族，单独聚为一支。PcCRCN-L在克氏原螯虾多个组织中均有表达，在肝胰腺中表达量最高；在性腺不同发育时期，肝胰腺以及卵巢组织中的PcCRCN-L基因表达量显著降低；低氧胁迫下，肝胰腺组织中PcCRCN-L表达量显著降低，复氧后显著升高。研究结果表明，PcCRCN-L与克氏原螯虾性腺发育密切相关，并参与了克氏原螯虾的低氧–复氧胁迫应激调控。
[期刊] 海洋渔业
[作者]
朱小玲
vasa和PL10同属于DEAD-box基因家族,具有依赖ATP的RNA解螺旋酶活性。本研究中,克隆了日本沼虾DEAD-box家族的两个成员,分别为vasa(Mnv-asa)和PL10(MnP-L10)。其中Mn-vasa全长2 408bp,包含1 803 bp的开放阅读框,编码601个氨基酸;Mn-PL10全长2 607 bp,包含2 127 bp的开放阅读框,编码709个氨基酸。成体组织的组织检测表明,Mnv-asa仅在性腺中表达,而Mn-PL10在性腺和其他器官中均有表达。Mn-vasa和MnP-L10在卵巢的原位杂交结果显示:Mn-PL10和Mnv-asa都在卵黄发生前期,卵黄发生期的...
[期刊] 中国水产科学
[作者]
李政道 李健 葛倩倩 王佳佳 何玉英 王培春
为研究钠/氢交换体(Na+/H+-exchanger,NHE)在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)响应pH胁迫过程中发挥的作用,首先采用静水毒性实验方法确定了中国明对虾酸碱半致死pH,然后利用RACE技术克隆了中国明对虾Na+/H+-exchanger isoform 3(命名为FcNHE3)基因,并通过荧光定量PCR及RNA干扰技术分析了其在pH胁迫下的表达特征及功能。结果显示,72 h酸性半致死pH和碱性半致死pH分别为5.2和9.1。克隆获得FcNHE3基因(Gen Bank:MF373587)cDNA序列全长3508 bp,开放阅读框2805 bp,编码934个氨基酸,具有信号肽和12个跨膜结构域;蛋白同源分析发现,FcNHE3与青蟹(Carcinus maenas)同源性最高,达到74%;系统进化分析显示,FcNHE3与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和青蟹亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,FcNHE3基因在鳃组织中表达量显著高于其他组织(P
[期刊] 中国水产科学
[作者]
孙盛明 戈贤平 傅洪拓 朱健 张世勇
利用cDNA末端快速克隆方法获得了青虾(Macrobrachium nipponense)的过氧化物还原酶基因(Prx)全长cDNA序列。该基因cDNA全长878 bp,包括72 bp的5′末端非翻译区,594 bp的开放阅读框(ORF),212 bp的3′末端非翻译区,开放阅读框编码198个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,所分离的青虾过氧化物还原酶基因包括两个半胱氨酸残基的区域"FYPLDFTFVCPTEI"和"GEVCPA"。系统进化树分析表明,青虾过氧化物还原酶基因与南美白对虾(Litopenaeus vannamei)过氧化物还原酶聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,过...
[期刊] 上海海洋大学学报
[作者]
曹磊 梁尧瑞 陶贤继 冯建彬 宫金华 冯冰冰 张敏
为探究低氧-复氧胁迫对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）仔虾存活及机体抗氧化因子的影响，本研究分别将罗氏沼虾仔虾放入溶解氧浓度1.0、1.2和1.4 mg/L的水体中进行胁迫，测定并估算胁迫开始后第4、8、12、24、48和72h存活率及半致死浓度(LC50)；随后将罗氏沼虾仔虾重新放入溶解氧浓度为2.2mg/L的水体中进行低氧胁迫72小时后，再将水体溶解氧浓度在4h内恢复至6.0mg/L、12h内恢复至8.4mg/L，测定低氧胁迫第0、4、8、12、24、48、72小时以及复氧胁迫后第4、12小时鳃、肝胰腺及肌肉组织中抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX）、磷酸水解酶（AKP、ACP）活力及丙二醛（MDA）含量。结果表明，罗氏沼虾仔虾在3种低氧浓度胁迫下死亡率及LC50值均随胁迫时间延长而逐渐上升，且低氧胁迫后第12、24小时死亡率显著高于第4、8小时死亡率（P＜0.05）。在低氧胁迫0至72小时内，罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺和肌肉组织SOD、CAT和GSH-PX活力呈现先上升后显著降低（P＜0.05）、复氧胁迫后又显著上升的变化趋势（P＜0.05）；在低氧胁迫72h后再复氧胁迫时，肝胰腺AKP、ACP活性显著高于鳃、肌肉组织，且AKP、ACP活力均呈现低氧胁迫时先显著上升（P＜0.05）后逐步降低、复氧后先降低再上升的变化趋势；鳃、肝胰腺和肌肉中组织MDA含量呈现先上升而后不断降低直至复氧后再次回升；在低氧胁迫第12～24小时内，鳃、肝胰腺、肌肉组织中SOD、CAT和GSH-PX活力的上升及下降均发生显著变化（P＜0.05）。综上所述，低氧及低氧-复氧胁迫均影响了罗氏沼虾仔虾存活及抗氧化能力，且低氧胁迫后第12～24小时为罗氏沼虾仔虾应激响应的关键时间点，研究结果将为揭示罗氏沼虾低氧及低氧-复氧胁迫下生理生化响应机制提供基础理论参考。
[期刊] 海洋渔业
[作者]
陈辉 王文清 朱小玲
从日本沼虾中克隆了cDNAs编码的蜕皮激素受体基因(MnEcR)核苷酸序列。将编码区中的配体结合域(LBD)氨基酸序列与甲壳纲和昆虫纲中已知EcR s的该区域进行比对,结果显示了高度的相似性,构建的系统进化树表明MnEcR与甲壳类物种的同源性要高于昆虫类物种。采用RT-PCR技术对MnEcR转录本在组织中的表达进行检测,结果显示在所有检测的组织中均有表达,并且在眼、头胸甲下的表膜和卵巢中表达尤为突出。接着采用实时RT-PCR技术对MnEcR转录本在胚胎发育各期的表达情况进行分析,结果显示从卵裂期到原肠期的表达水平逐渐上升,从前无节幼体期开始至后无节幼体期表达水平呈显著的增加,并在后无节幼体期时...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
魏威 何玉英 李朝霞 周雨欣 李健 谢拥军
采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) ATG5基因cDNA全长，命名为FcATG5。利用实时荧光定量技术分析了FcATG5的组织表达及其在pH和碳酸盐碱度胁迫下的表达特征，并利用RNAi技术验证其功能。基因分析显示，FcATG5 cDNA全长为2225 bp，开放阅读框为810 bp，编码269个氨基酸，预测其编码的蛋白质分子量为31.10kDa，理论等电点为5.59，为疏水性蛋白，包含一个APG5自噬相关蛋白结构域，无跨膜结构，不包含信号肽。同源性和系统进化分析显示，FcATG5具有高度保守性，与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高，达98.14%。组织表达分析显示，FcATG5在中国对虾各组织中均有表达，其中，肌肉中表达量最高(P<0.05)，血淋巴细胞中最低(P<0.05)，表明该基因的表达量越高，越有利于中国对虾存活。结果表明，FcATG5在pH、碳酸盐胁迫下的表达量均显著升高(P<0.05)，推测自噬可能参与中国对虾应对非生物胁迫的调控。本研究结果对水生动物特别是甲壳动物中细胞自噬研究具有重要的借鉴意义，有助于推进中国对虾盐碱水养殖的研究进程。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
姚万龙 何玉英 刘萍 李健 王清印
采用ＲＡＣＥ技术克隆获得中国明对虾（ＦＥｎｎＥＲｏｐＥｎＡＥｕｓ ＣｈｉｎＥｎｓｉｓ）丝裂原活化蛋白激酶激酶３（ＭＫＫ３）基因全长Ｃ ＤｎＡ序列，并对该序列进行分析。结果表明，该基因全长为１４３４ ｂｐ，开放阅读框长１０１１ ｂｐ，５′非编码区长３３ ｂｐ，３′非编码区长３９０ ｂｐ，将该基因命名为ＦＣ ＭＫＫ３。推测该基因编码３３６个氨基酸，分子量为３７．８９ Ｋ Ｄ，理论等电点为６．０８。同源性和系统进化分析表明，ＦＣ ＭＫＫ３基因与丽蝇蛹集金小蜂（ｎＡｓｏｎｉＡ ｖｉｔＲｉｐＥｎｎｉｓ）和地中海实蝇（ＣＥＲＡｔｉｔｉｓ ＣＡｐｉｔＡｔＡ）的相似性分别为６９％和６８％，与其他节肢动物ＭＫＫ．．．
[期刊] 中国水产科学
[作者]
胡硕 何玉英 李健 张海恩 韩旭
采用RACE技术克隆了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)V-ATPase c亚基基因,命名为FcVHA-c基因,检测该基因在高pH胁迫下的基因应答,并采用RNAi技术验证其功能。基因分析表明,FcVHA-c基因cDNA全长为2128bp,开放阅读框483bp,编码160个氨基酸,预测蛋白分子量为16kD,理论等电点7.82,具有4个跨膜结构域。同源性和系统进化分析表明,FcVHA-c具有较高的保守性,其中与南美白对虾(Penaeusvannamei)同源性最高,为99%,与南美白对虾首先聚为一支。组织表达分析显示, FcVHA-c基因在中国对虾各个组织中均有表达,在鳃中表达量显著高于其他组织(P<0.05),表明该基因表达量越高,越有利于中国对虾的存活。本研究结果表明,FcVHA-c基因参与了高pH胁迫下中国对虾的离子调控,高pH胁迫抑制FcVHA-c基因的调控能力。
[期刊] 水产学报
[作者]
姚万龙 何玉英 刘萍 李健 王清印
为初步研究中国明对虾MKK4的生物学功能,采用RACE技术克隆获得中国明对虾MKK4基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾MKK4基因全长为2 064 bp,开放阅读框长1 221 bp,5'非编码区长214 bp,3'非翻译区长629 bp。将该基因命名为Fc MKK4。推测该基因编码406个氨基酸,预测分子量为45.94 ku,理论等电点为8.50。同源性和系统进化分析发现Fc MKK4与肩突硬蜱和印度跳蚁的同源性分别为80%和78%,与其他节肢动物MKK4聚为一支。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK4基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为肝胰腺。氨氮胁迫后...
[期刊] 水产学报
[作者]
江红霞 林鑫辉 李书凯 王洁琛 李学军
为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12～72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12～72 h和6～72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李明栋 王佳佳 葛倩倩 秦桢 刘萍 李健 李吉涛
水通道蛋白(aquaporin)是一种细胞膜上特异性转运水分子及其他中性代谢分子的膜蛋白家族，对生物的细胞内外渗透压稳定具有重要的调节作用。为了了解水通道蛋白在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)应对碱度胁迫中的作用，本研究利用RACE技术成功克隆了脊尾白虾水通道蛋白4(aquaporin 4,EcAQP4)与水通道蛋白11(aquaporin 11,EcAQP 11)基因c DNA全长，EcAQP4基因的开放阅读框为621 bp，编码206个氨基酸，预测分子量为21.673 kDa，理论等电点为8.30，为疏水性蛋白，具有5个跨膜结构域；EcAQP11基因的开放阅读框长度为783bp，编码260个氨基酸，预测蛋白分子量为28.490 kDa，理论等电点为5.40，为疏水性蛋白，具有4个跨膜结构域。序列比对结果显示，EcAQP4基因与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)同源性最高，为94.63%;EcAQP11与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高，为81.47%。为验证水通道蛋白的功能，利用RNA干扰技术特异性沉默EcAQP4和EcAQP11基因，结果显示，碳酸盐碱度胁迫后，注射干扰后的脊尾白虾死亡率显著升高，EcAQP4干扰组72 h死亡率达到45%,EcAQP11干扰组72 h死亡率达到55%，与对照组差异显著(P<0.05)。同时发现，EcAQP4干扰组在碳酸盐碱度胁迫24、48与72h时的血液渗透压变化幅度显著高于对照组(P<0.05),72h时渗透压显著升高(P<0.05);EcAQP11干扰组血液渗透压在3个时间点均显著升高(P<0.05)。以上结果表明，水通道蛋白在脊尾白虾应对碱度胁迫过程中起到了调节渗透压、维持体内外离子平衡的作用。
关键词：
脊尾白虾 水通道蛋白 基因克隆 渗透压
[期刊] 水产学报
[作者]
王文锋 关建义 吕黎 刘方 杨洪 宁黔冀
利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4...
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