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[期刊] 水产学报
[作者]
江红霞 林鑫辉 李书凯 王洁琛 李学军
为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,MnSAA基因cDNA全长649 bp (GenBank登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12～72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12～72 h和6～72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。
[期刊] 淡水渔业
[作者]
李屹铮 张帅帅 刘雪巍 张冉 林鑫辉 张猛 王磊 于淼 乔志刚 江红霞
为了探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)核糖体蛋白S3a(MnRPS3a)在其卵巢发育中的功能，利用cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR技术获得了MnRPS3a基因的全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫荧光(IF)技术分别进行了该基因的表达模式和蛋白定位分析。结果显示，MnRPS3a基因cDNA全长902 bp,共编码266个氨基酸；MnRPS3a与墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RPS3a氨基酸序列相似性最高，进化上的亲缘关系也最近；在不同组织中，MnRPS3a基因在肌肉中的表达量最高；在不同发育阶段卵巢中，MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢中的表达量最高；注射5-羟色胺(5-HT)能诱导日本沼虾卵巢MnRPS3a和卵黄蛋白原(Vg)基因表达升高，而注射多巴胺(DA)则抑制这2个基因表达。MnRPS3a蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的滤泡细胞、Ⅲ期和Ⅳ期卵巢卵母细胞的细胞质中。结果表明MnRPS3a可能在日本沼虾卵巢发育调控中发挥重要的作用。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
江红霞 李喜莲 侯富军 刘勇杰 李飞 张宇飞 郭建林 贾永义 顾志敏 刘小林
半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CST)是一种能够可逆结合并抑制半胱氨酸蛋白酶类的活性的蛋白,为了明确日本沼虾(Macrobrachium nipponense)CST基因(Mn CST)序列及其在日本沼虾卵巢中的作用,本研究利用RACE方法克隆获得日本沼虾Mn CST全长cDNA序列,利用qRT-PCR分析了其在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达情况,并利用RNA干扰(RNAi)技术初步分析了Mn CST在日本沼虾卵巢发育中的作用。结果显示,Mn CST cDNA序列全长6199 bp,包含1183 bp 5′非编码区、2304 bp 3′非编码区和2709 bp开放阅读框,编码903个氨基酸残基,其氨基酸序列上有6个cystatin-like(半胱氨酸蛋白酶抑制因子样)结构域和42个磷酸化位点;Mn CST基因在各个组织中均有表达,肠中表达量最高;日本沼虾不同发育阶段的卵巢中均有Mn CST基因表达,Ⅳ期卵巢中表达量最高,Ⅱ期卵巢中表达量最低;Mn CST基因在日本沼虾卵巢中的表达变化与组织蛋白酶B(Cts B)和组织蛋白酶L(Cts L)基因的表达变化基本是一致的,但对卵黄蛋白原(Vg)基因的表达没有直接影响。Mn CST在日本沼虾卵巢中的作用可能主要是抑制Cts B和Cts L的活性,在日本沼虾卵巢发育过程中对Vg的水解起间接的调控作用。
[期刊] 水产学报
[作者]
陈昊 戴琴 干雅梅 高焕 阎斌伦 赖晓芳
为探究strawberry Notch1基因（SBNO1）在甲壳动物中的免疫功能，对脊尾白虾SBNO1的cDNA序列全长、系统进化、组织分布以及副溶血弧菌感染后SBNO1和Notch信号通路中相关基因表征进行了研究。结果显示，脊尾白虾SBNO1 cDNA序列全长4 353 bp，共编码1 380个氨基酸，预测相对分子量158.91 ku，理论等电点4.81。qPCR分析显示，脊尾白虾SBNO1在各组织中均有表达，其中在肝胰腺中表达量最高，性腺次之。利用RNAi干扰SBNO1显示，脊尾白虾在感染副溶血弧菌后，干扰组死亡率显著高于未干扰组。副溶血弧菌感染脊尾白虾后显著影响了Notch信号通路中SBNO1、Numb与Delta在肝胰腺中的转录情况，而Jagged表达差异不显著。SBNO1和Numb的表达量随时间变化都呈现出先上升后下降的趋势，Delta的表达量呈现出先下降后上升的趋势。研究表明，Notch信号通路参与了脊尾白虾副溶血弧菌感染后的免疫。本研究有助于阐明无脊椎动物先天免疫的机制，为抗病脊尾白虾的分子育种提供理论依据。
[期刊] 水产学报
[作者]
尹丝雨 何雨欣 于娇 张亦陈 刘逸尘 耿绪云 孙金生
丝氨酸蛋白酶(SP)是一类分布广泛的蛋白水解酶，行使着一系列重要的生理功能，包括参与消化作用、血液凝结、胚胎发育和免疫应答过程等，但在甲壳动物中仅见初步报道。对虾的养殖持续面临着病害的困扰，深入开展对虾免疫防御机制研究，将会为寻找抗病新思路提供借鉴。本研究利用RACE技术克隆获得了一个新的凡纳滨对虾丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologs, SPHs)基因(Lv-SPH)的全长cDNA序列，通过生物信息学方法分析了其序列特点，并利用实时荧光定量PCR (qPCR)方法探讨了其组织分布特征和应答病毒感染的表达变化模式。生物信息学分析显示该基因全长1 249 bp，开放阅读框(ORF)区长1 005 bp,5′-UTR为156 bp,3′-UTR为88 bp,ORF区编码334个氨基酸，氨基端的16个氨基酸为预测的信号肽序列。经在线分析软件SMART分析显示，Lv-SPH含有一个clip结构域和一个高度保守的SP结构域(Tryp-SPc)，后者具有3分子活性催化位点，前2个是组氨酸和天冬氨酸，第3位为甘氨酸。该基因在凡纳滨对虾各种组织中有不同程度的表达，其中在血细胞中表达量最高，在肝胰腺、心脏和肠道中广泛表达，而在肌肉中表达量最低。注射白斑综合征病毒(WSSV)后24 h,Lv-SPH的相对表达量显著升高，病毒感染后48 h达到最高，约为对照组的3倍。Lv-SPH具备典型的SPH家族成员特征，具有一定的组织表达特异性，WSSV可以显著诱导该基因表达上调，表明其可能参与了WSSV引发的凡纳滨对虾免疫应答过程。研究结果为深入探讨对虾天然免疫调控机制提供了参考，在对虾健康养殖及病害防治方面具有潜在的应用价值。
[期刊] 中国水产科学
[作者]
王改玲 骆彦萍 孙宝剑 徐镇 许巧情 聂品
用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜(Siniperca chuatsi)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因的全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358bp,其5l非编码区包含30bp,3l非编码区包含337bp;开放阅读框包含2991bp,编码996个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%～72%之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发...
[期刊] 水产学报
[作者]
王欣欣 孙宝剑 昌鸣先 聂品
用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)分泌型的重链全长cDNA。其cDNA全长为1 940nt,包含5′非编码区20nt,3′非编码区189nt,开放阅读框1 731nt,编码576个氨基酸。序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%。ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点。进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝。荧光定量PCR显示草鱼IgM的mRNA主要在头肾、中肾和脾脏中表达,表明了这三个免疫器官是IgM表达...
关键词：
草鱼 免疫球蛋白M 克隆 荧光定量PCR
[期刊] 水产学报
[作者]
崔峥 朱小玲 邱高峰
Vasa基因具有在性腺中特异表达的特点,在生殖细胞分化与发育过程中起重要作用。从日本沼虾精巢cDNA中克隆了vasa基因的阅读框,连接到pET-32a载体,构建重组表达质粒pET32a-vasa,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导融合表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约85ku,表达量约占包涵体总蛋白的48.7%,Western-blotting检测表明,融合蛋白可特异地被anti-HIS标签抗体识别。用Ni2+-NTA纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备获得多克隆抗体,ELISA显示该抗体效价达1∶160000,Western免疫鉴定显示该抗体不仅能识...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄浦江 黄郁葱 简纪常 吴灶和 鲁义善 张雪利
参照GenBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为37℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1∶30 000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原...
[期刊] 水产学报
[作者]
韩俊英 李健 李吉涛 常志强 陈萍 李华
克隆了脊尾白虾热休克蛋白基因全长cDNA,并进行了序列分析。该基因由2 250 bp的碱基组成,开放阅读框长1 959 bp,编码由652个氨基酸组成的蛋白,基因两翼分别存在83 bp(5'端)和208 bp(3'端)的非翻译区,将该基因命名为Ec-HSP70。与其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源性比较发现,与甲壳动物的同源性都在90%以上,表明该蛋白属于热休克蛋白HSP70家族。聚类分析表明,脊尾白虾热休克蛋白氨基酸序列与中国明对虾和凡纳滨对虾紧密聚为一支,之后聚类顺序依次为斑节对虾、日本囊对虾、刀额新对虾等。通过荧光定量RT-PCR对该基因在肝胰腺、肌肉的表达分析表明,温度、pH和氨氮...
[期刊] 华中农业大学学报
[作者]
冯建军 郭松林 林 鹏
通过RTGPCR技术克隆欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)Ig轻链基因c DNA全长序列,命名为Aa Ig L,其全长为1016bp,开放阅读框为714bp,编码238个氨基酸.将该基因片段与p ETGhis载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDSGPAGE和Westernblotting分析,结果表明新增的27ku蛋白条带与预期值相符,且与兔抗欧洲鳗鲡Ig M血清发生特异性显色反应,证实了Aa Ig L基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;实时荧光定量PCR检测结果发现:Aa Ig L在欧洲鳗鲡各组织中均有表达,其中脾脏的表达量最高,肾脏和心脏...
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
王双艳 王磊 陈张帆 崔忠凯 周茜 陈松林
本研究根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组数据库中预测的多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)序列,通过PCR和RACE技术获得了半滑舌鳎pIgR基因cDNA,全长为1419 bp,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,5′UTR区域为109 bp,3′UTR区域为290bp。保守结构域分析显示,半滑舌鳎pIgR蛋白包含1个信号肽,2个免疫球蛋白功能域(Ig-like domain, ILD)和1个跨膜结构域。经蛋白序列同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthy solivaceus)的pIgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,pIgR基因在健康半滑舌鳎的不同组织中均有表达,在鳃中表达较高,在肌肉中表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病原感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中均呈先上升后下降的趋势,其中,在脾脏和鳃中48 h达到最高值,在肝脏、肾脏和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。上述结果表明,pIgR基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌的免疫应答中发挥重要作用。
[期刊] 沈阳农业大学学报
[作者]
林景卫 关山越 钟鸣 陈丽静 李浩戈 张丽 范文丽 李天来
[期刊] 渔业科学进展
[作者]
李坤明 徐文腾 扶晓琴 陈松林
蛋白激酶C(PKC)广泛参与哺乳动物T、B淋巴细胞涉及的免疫反应并发挥重要作用,然而PKC在鱼类免疫过程中的作用却少有报道。本研究在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了PKC家族的典型成员PKCα(命名为CsPKCα),并进行了分子特征和表达模式分析。CsPKCα的cDNA全长为2315 bp,其中,开放阅读框(ORF)为2013 bp。qRT-PCR分析显示,CsPKCα在各个组织中广泛表达,其中,在鳃、肝脏、皮肤和肠中具有较高的转录水平,表明CsPKCα可能在免疫过程中发挥作用。随后检测了CsPKCα在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后6种免疫相关组织(鳃、肝脏、皮肤、肠、脾脏和肾)中不同时间点的表达水平,发现细菌侵染后24 h或48 h,CsPKCα在鳃、肾脏、皮肤和脾脏中显著上调,侵染后12 h在肝中有显著性下调。研究表明,CsPKCα可能在应对哈维氏弧菌的免疫应答中发挥作用,但是否参与病原菌侵染的巨噬细胞激活以及与T、B细胞相关的信号通路还需要进一步研究。这是关于PKCα参与鱼类细菌性免疫反应的首次报道。
[期刊] 中国农业科学
[作者]
顾沛雯 吴云锋 王海妮 安凤秋
【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp1051/Imp2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别...
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