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[期刊] 华北农学报
[作者]
王芳 胡波 任雪枫 范志宇 张则斌 徐为中 何孔旺
用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定...
关键词：
家兔 γ-干扰素 克隆 重组杆状病毒
[期刊] 中国农业科学
[作者]
王彦彬 崔保安 陈红英 王亚宾 张红英 魏战勇
【目的】为获得重组猪干扰素α。【方法】本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟猪干扰素α基因插入供体质粒pFastBacⅠ多克隆位点,置于pH启动子控制下,昆虫可识别的蜂素信号肽(honeybeemelittinsignalpeptide,HBM)取代猪干扰素α原有信号肽以实现分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。【结果】重组蛋白通过间接免疫荧光、Western-blot证明重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
闫若潜 谢彩华 吴志明 张志凌 刘光辉 刘梅芬
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rCh...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 周斌 陈德胜 陈溥言
提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 1...
关键词：
猪γ干扰素 基因改造 原核表达 分离纯化
[期刊] 北京林业大学学报
[作者]
张立娜 刘培欣 曹殿军 闫丽辉 贾竞波 危艳武
以含有全长猪γ干扰素基因的质粒为模板,通过PCR方法扩增猪γ干扰素并引入酶切位点,酶切后与PCI真核表达载体连接在一起,测序后经比较,所扩增序列同Genebank报道的IFN-γ序列同源性为99·8%.将重组质粒转染PK细胞,检测所转染的pIFN-γ的抗病毒活性.试验结果表明,转染pIFN-γ试验组与正常细胞接毒对照组比较有显著差异,说明所构建的重组质粒转染后具有抗病毒作用.
关键词：
猪γ干扰素 真核表达 活性测定
[期刊] 林业科学研究
[作者]
亓倩 于淑惠 孙涛 王雪庆 刘博文 杨璞 陈晓鸣
［目的］本研究欲利用Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ表达系统，在Ｓｆ９细胞中表达ＷＳ。［方法］将ＷＳ编码序列克隆到质粒ｐ ｆａＳｔＢａｃ～（ｔＭ）Ｈｔ Ｂ后，转化大肠杆菌ＤＨ１０Ｂａｃ～（ｔＭ），经抗性和蓝白斑筛选，获得重组杆粒ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌ ＷＳ。将ｒ ＢａｃＭｉＤ／ＥｐＥｌＷＳ转染Ｓｆ９细胞。［结果］免疫荧光标记检测表明：ＷＳ在受感染细胞的细胞质中表达。［结论］本研究成功表达了白蜡虫ＷＳ，为白蜡虫ＷＳ的生化特性研究奠定了基础。
[期刊] 华北农学报
[作者]
王丹 解文杰 朱叶飞 赵金良 陈晓武
为了分析尼罗罗非鱼干扰素调节因子１（ＩＲＦ１）的表达规律及其功能，克隆了尼罗罗非鱼ＩＲＦ１基因ｃ ＤＮＡ全长，与其他脊椎动物ＩＲＦ１基因进行比对，构建ＩＲＦ家族系统进化树。然后使用Ｐｏｌｙ Ｉ∶ｃ对尼罗罗非鱼进行体内注射诱导抗病毒免疫反应，利用荧光定量ＰｃＲ技术检测处理组和对照组中尼罗罗非鱼各组织ＩＲＦ１基因的表达差异。最后构建尼罗罗非鱼ＩＲＦ１基因真核表达载体，对其进行细胞定位。结果表明，尼罗罗非鱼ＩＲＦ１有８８８ ｂＰ的开放读码框，编码２９５个氨基酸的蛋白序列。该蛋白Ｎ端高度保守，并含有６个保守的色氨酸，具有ＤＮＡ结合结构域。对蛋白相似率的计算发现尼罗罗非鱼与斑马鱼ＩＲＦ１相似度为５２．１．．．
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
朱善元 王安平 吴双 王永娟 左伟勇 洪伟鸣
根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到E.coli DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了...
关键词：
禽腺联病毒 Rep基因 昆虫细胞 表达
[期刊] 华北农学报
[作者]
陈红英 宋凌云 崔保安 胡功政 贾艳艳 郭显坡
通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序。序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合。经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Westernblot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白。表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Ve...
关键词：
鸡 α干扰素 克隆 原核表达 抗病毒活性
[期刊] 福建农林大学学报(自然科学版)
[作者]
林董 何柳 谢荔岩 吴祖建 林奇英 谢联辉
应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的4个基因NS2、NS3、CP和SP,并将它们克隆至pMD-18-T载体上.得到的重组质粒pMD-18-T-NS2、pMD-18-T-NS3、pMD-18-T-CP和pMD-18-T-SP经XbaⅠ/HindⅢ双酶切,分别与经相同方法酶切的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california nuclear polyhedrosis virus,AcM-NPV)转移载体pFastBacHTb相连接,构建重组转移质粒pFastBacHTb-X(pFastBacHTb-NS2、p...
[期刊] 水产学报
[作者]
黄锋涛 熊海林 曹胜波 熊传喜 王敏 王卫民 吴兵 刘玉林 刘学芹
为构建基于杆状病毒表达系统的CCV新型亚单位疫苗,将CCV的囊膜蛋白基因ORF6克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM 1质粒中,并将阳性重组转座质粒转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得重组子rBacmid-ORF6。在脂质体介导下将该重组子转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒AC-ORF6。AC-ORF6感染的sf9昆虫细胞,经超薄切片电镜观察,可见重组杆状病毒呈多粒包埋,经间接免疫荧光、Western-blotting检测,CCV的ORF6蛋白可以在感染了AC-ORF6的sf9细胞中表达。研究表明,获得了插入ORF6基因的重组杆状病毒,并且该基因可以在重组杆状...
[期刊] 华北农学报
[作者]
王凤芝 温立斌 何孔旺 姚火春 王小敏
为了鉴定类猪圆环病毒P1 VP1蛋白能否在体外自组装成病毒样颗粒(VLPs),首先PCR扩增P1 ORF1基因,利用p Fast BacTM1载体构建重组质粒,通过脂质体转染在Sf9细胞中表达P1 ORF1基因。然后通过RT-PCR技术及Western Blot分别从转录和蛋白质水平上鉴定该基因的表达,应用透射电镜观察该蛋白质是否形成了VLPs。结果显示,转染Sf9细胞后,第5天开始出现细胞病变;从接毒细胞中提取总RNA,经Recombinant DNaseⅠ处理除去基因组DNA后,RT-PCR能够扩增出362 bp的目的片段;收获接毒后72 h的细胞,Western Blot分析显示,P1 ...
[期刊] 南京农业大学学报
[作者]
曹瑞兵 王艳 魏建超 陈溥言
亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-...
[期刊] 中国农业科学
[作者]
李洪涛 马波 王君伟 金红岩
【目的】检测重组鹅IFN-γ的生物学活性。【方法】将鹅IFN-γ成熟蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET30a,杆状病毒转移载体pMelBacA和pBlueBacHis2A。对鹅IFN-γ成熟蛋白进行原核和真核表达系统表达;利用体外活性试验检测表达产物的生物学活性。【结果】原核和真核表达系统表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白,并制备其原核表达产物的多克隆抗体;重组鹅成熟IFN-γ可以诱导鹅巨噬细胞产生NO,并能抑制GPMV在鹅胚成纤维细胞中的增殖。【结论】重组鹅成熟IFN-γ具有鹅巨噬细胞激活活性和抗病毒活性。
[期刊] 水产学报
[作者]
罗卫 田飞焱 刘荭 陈焕春 李惠芳 刘宗晓 王侃 蔡伊娜 吕建强
利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37ku的特异性蛋白带,Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带。试验结果表明,AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良...
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病毒性神经坏死病毒 衣壳蛋白 病毒样颗粒
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