【目的】建立体外分离、培养和扩增牛骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法,研究牛龄对BMSCs增殖特性的影响。【方法】用贴壁筛选法纯化新生牛与成年牛的BMSCs,传代扩增,测定生长曲线和贴壁率,并进行形态学观察。【结果】通过体外培养,可使体内环境下低丰度的BMSCs实现扩增。新生牛BMSCs易于分离纯化,贴壁率及增殖能力显著高于成年牛。【结论】新生牛比成年牛更适于BMSCs的提取。BMSCs的增殖生长特性与年龄密切相关,增殖能力和活性随着年龄的增加而降低,成功地建立了一种分离培养牛BMSCs的方法,分析了BMSCs部分生物学特...

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力。结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨...

为了确定大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)体外分离和培养的方法,建立了稳定的MSCs体外培养扩增体系,通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs,观察了细胞的形态,研究了其增殖及生长特征,并应用流式细胞术测定了细胞周期及CD29,CD44,CD45和HLA-DR的表达。结果表明,在体外培养条件下大鼠MSCs贴壁生长,为成纤维细胞样;CD45和HLA-DR的表达呈阴性,CD29和CD44的表达呈阳性;细胞周期的G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。说明建立的体外培养扩增体系可获得形态单一、生长稳定、增殖性较强、较均一的大鼠MSCs。

为探究猪（Sus scrofa）骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, PBMSCs）成软骨分化过程中能量代谢动态变化以及与软骨形成之间的关系，本研究分离并鉴定猪骨髓间充质干细胞，并通过建立诱导分化培养体系获得猪软骨细胞。对PBMSCs成软骨诱导分化第1、6、12和18天的细胞进行软骨形成标记基因、能量代谢相关基因表达模式分析以及能量代谢产物含量检测，且对软骨形成标记基因与能量代谢产物进行相关性分析。结果表明：1）在成软骨分化过程，软骨形成标记基因II型胶原α1链（Collagen type II alpha 1 chain,COL2A1）、SRYbox转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)、聚集蛋白聚糖（Aggrecan,ACAN）、基质金属蛋白酶13(Matrix metallopeptidase 13,MMP13)、RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2,RUNX2)表达水平显著提高（P<0.05）；糖酵解限速酶基因己糖激酶1(Hexokinase 1,HK1)、丙酮酸激酶L/R(Pyruvate kinase L/R,PKLR)和乳酸转运关键基因溶质载体家族16成员1(Solute carrier family 16 member 1,SLC16A1)表达水平显著提高（P<0.05），葡萄糖转运关键基因溶质载体家族2成员4(Solute carrier family 2 member 4,SLC2A4)表达水平显著降低（P<0.05）;2）随着成软骨分化时间增加，胞内ATP含量和葡萄糖含量显著降低（P<0.05），胞内乳酸、乳酸和葡萄糖比率显著增加（P<0.05）。3）成软骨分化关键基因与能量代谢产物的相关性分析表明，PBMSCs成软骨过程与糖酵解代谢显著相关（P<0.05）。综上，本研究成功建立了一种诱导PBMSCs分化成软骨细胞的方法，并发现在间充质干细胞诱导成软骨细胞过程中，细胞氧化磷酸化水平逐渐降低，糖酵解代谢逐渐增强，为后续深入解析猪体长发育机制提供新视角。

本研究以山羊睾丸组织为材料,用RT-PCR法成功克隆了山羊DAZL基因的cDNA序列950 bp,测序和生物信息学分析表明,其含有885 bp的完整开放阅读框(ORF),编码295个氨基酸,与牛的氨基酸序列同源性为97.97%,编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复基序;将山羊DAZL基因亚克隆至表达载体pEGFP-C1上,构建了山羊DAZL基因真核表达载体pEGFP-DAZL,采用脂质体法将其瞬时转染至山羊骨髓间充质干细胞(BMSC)中,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在山羊BMSC内的表达和定位。

构建含有Zic3基因的真核表达载体pEGFP-Zic3,并转染小梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC),观察BMSC中Zic3的表达情况。用RT-PCR技术获得Zic3基因,并将其连接到真核表达载体pEGFP-C1中,获得真核表达载体质粒pEGFP-Zic3,采用双酶切法和DNA测序鉴定构建的载体是否正确。体外培养小梅山猪BMSC,通过免疫细胞化学法检测小梅山猪BMSC表面标志。采用脂质体法将pEGFP-Zic3转染BMSC,通过荧光显微镜观察确定重组质粒在小梅山猪BMSC内的表达和定位,用RT-PCR法检测Zic3的表达情况,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。双酶切和测序证实已成功构建含目的...

从7日龄北京油鸡胚胎肝脏中分离间充质干细胞,原代培养并传代至15代,免疫荧光法检测造血祖细胞/肝卵圆细胞的表面标志物CD34、CK19呈阴性表达;RT-PCR检测CD29、CD44、CD71、CD73呈阳性表达。尝试不同培养条件对细胞生长曲线的影响,选取最佳培养方案,同时对细胞进行细胞周期测定。肝脏间充质干细胞通过不同诱导液被成功诱导分化成脂肪细胞、心肌细胞,结果表明,从鸡胎肝中分离获得的间充质干细胞具有和人类间充质干细胞相似的生物学特性及分化潜能,其所具有多向分化的潜能,为今后临床广泛应用提供了可能。

【目的】通过碱性调宁蛋白(h1-calponin)基因与五指山小型猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)成骨分化关系的研究,探讨成骨分化机制。【方法】添加成骨分化液对BM MSCs进行成骨分化诱导,采用茜素红染色的方法鉴定细胞成骨分化的程度;通过定量PCR分析h1-calponin基因及成骨相关基因骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、核心结合因子α1(core binding factor a1,Cbfα1)及核心结合因子β(core binding factor beta,C...

为研究鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞生物学特性,取30～50日龄鲁西黄牛胚胎四肢骨骼肌,分离培养鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞。结果显示,试验成功地分离了鲁西黄牛胚胎骨骼肌卫星细胞,原代培养并传代至16代,免疫细胞化学染色检测卫星细胞表面特异性标志Desmin、MyoD呈阳性表达,RT-PCR检测Desmin、c-Met、Myf5、pax7呈阳性表达;绘制生长曲线,结果说明细胞具有较强增殖能力;应用流式细胞仪对细胞进行周期分析,结果显示S期细胞所占比例为8.94%;骨骼肌卫星细胞向成肌细胞诱导10d后,免疫细胞化学染色检测成肌特异性标志骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达;骨骼肌卫星细胞向脂肪细胞诱导7d后,油红...

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋

近几年来延黄牛因肉质优良、口味独特、有典型的大理石花纹等特点入选为我国五大良种牛之一,越来越多地受到消费者的青睐。为建立延黄牛前体脂肪细胞的体外培养体系,从细胞和分子水平探索延黄牛脂肪细胞的生物学特性及潜在的分化机制,采用胶原酶消化法对延黄牛皮下前体脂肪细胞进行分离,对其进行形态学观察并绘制生长曲线,油红O染色法检测成脂诱导分化过程中的脂质积累,利用甘油三酯酶法测定细胞内甘油三酯,采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测脂肪细胞成脂标志基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋

[目的]本试验旨在分离、多向诱导分化并鉴定犬脂肪间充质干细胞。[方法]无菌条件下采取经过健康筛查的犬腹部脂肪,机械剪碎,采用1 g·L~(-1)胶原酶Ⅰ型消化,用DMEM+10%FBS培养,观察细胞形态特征,流式细胞术分析细胞表面抗原标志的表达,并检测其体外成脂、成骨、成软骨分化能力。[结果]运用酶消化法可以从犬新鲜脂肪组织中分离到脂肪间充质干细胞,流式分析结果显示其高表达CD29(99.9%),低表达CD34(0.5%)和CD45(0.3%)。这些细胞在体外经诱导可以分化成为骨、软骨和脂肪。[结论]犬腹部脂肪组织中分离得到脂肪间充质干细胞,这些细胞具有多向分化能力。

为研究鱼类骨组织细胞的特征,实验建立了团头鲂骨组织细胞的体外分离培养方法,并对其生物特性进行了鉴定。以3月龄团头鲂尾椎骨及肋骨为实验材料,利用组织块培养法和胰蛋白消化法分别进行骨组织细胞培养,确定最佳培养条件:采用组织块培养法,28°C培养,M-199培养基中加入体积分数为20%的胎牛血清、25 ng/m L表皮生长因子EGF和25 ng/m L碱性成纤维生长因子b FGF。细胞生物学特性鉴定结果显示:细胞碱性磷酸酶、钙化结节茜素红染色及矿化结节von Kossa氏法染色均呈阳性,表明所培养的细胞具有典型

短足筒天牛（ＯｂｅｒｅａｆｅｒｒｕｇｉｎｅａＴｈｕｎｂｅｒｇ）是危害大叶黄杨的一种主要钻蛀性害虫，在合肥地区１ａ发生一代，以老熟幼虫在多年生枝干内越冬，翌年４月下旬开始化蛹，５月中旬为羽化高峰期，６月上、中旬为卵孵化盛期，１０月中、下旬开始越冬。其发生受光照的影响较大，同时成虫产卵对树势强弱有较强的选择性，植株各部位发生情况亦不相同。采取修剪的方法防治效果最佳。

【目的】骨骼肌是动物机体的重要组成成分，其生长发育直接影响畜禽肉产量，叉头转录因子O1(forkhead box protein O1, FoxO1)作为重要的转录调控因子，其与骨骼肌生长发育密切相关。探究过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡与分化的作用，为肉牛遗传改良提供基础材料。【方法】采集牛的多个组织样品，提取其RNA并反转录，利用实时荧光定量PCR(qPCR)构建FoxO1组织表达谱。利用酶消化法分离得到牛骨骼肌细胞，通过观察其分化后肌管的形成以及qPCR检测其分化标志基因的表达情况来检验所分离细胞的分化性能。利用免疫荧光技术对牛骨骼肌细胞进行FoxO1亚细胞定位。设计并包装牛FoxO1过表达腺病毒，以提高牛骨骼肌细胞内FoxO1的表达。利用EdU染色检测过表达FoxO1对细胞相对增殖率的影响。利用流式细胞术检测过表达FoxO1对细胞周期分布的影响。利用qPCR检测过表达FoxO1对牛骨骼肌细胞增殖、凋亡和分化相关基因表达水平的影响。【结果】组织表达谱结果显示FoxO1在多个组织中均有表达，其在成年牛的背脂中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低，且FoxO1在犊牛背最长肌组织中的表达量要极显著高于成年牛的（P<0.01）。亚细胞定位结果显示FoxO1在牛骨骼肌细胞的细胞核和细胞质内均有表达，其细胞核内荧光强度高于细胞质。成功构建FoxO1过表达载体，并完成FoxO1重组过表达腺病毒的包装与扩繁，在感染牛骨骼肌细胞后，能显著提高FoxO1表达水平（P<0.01）。EdU检测显示过表达FoxO1会显著降低细胞增殖率（P<0.01），流式细胞周期检测显示过表达FoxO1会显著增加G1期细胞数并减少S期和G2期细胞数，抑制细胞G1/S期的转化，并减少G2期细胞的形成。利用qPCR进一步检测发现，增殖相关基因PCNA、CDK1、CDK2、CCNA2、CCNB1、CCND1和CCNE2均极显著下调（P<0.01），促凋亡相关基因BAD和BAX显著上调以及抑凋亡基因BCL2显著下调（P<0.05）。过表达FoxO1导致牛骨骼肌细胞肌管形成量减少，qPCR检测结果发现，骨骼肌分化相关基因MYOD、MYOG、MYF5、MYF6和MYHC的表达量显著下调（P<0.05）。【结论】FoxO1在牛的不同组织中均有表达，是一个广泛存在的转录调控因子，并且在背最长肌组织生长发育不同阶段存在表达差异，起到阶段调控作用。FoxO1在细胞核和细胞质中均发挥重要的转录调控作用，特别是在细胞核内。过表达FoxO1可能通过抑制细胞增殖相关基因和肌细胞分化相关基因的表达，从而抑制牛骨骼肌细胞的增殖与分化，并且可能通过上调促凋亡基因的表达和下调抑凋亡基因的表达来促使牛骨骼肌细胞凋亡的发生。